结核分枝杆菌胞内表达上调分泌性基因集的T细胞抗原筛选及其免疫保护功能鉴定

Immunodominant antigens of Mycobacterium tuberculosis (Mtb), so far, are mainly from filtered supernatant of in vitro cultured Mtb other than altered gene set of Mtb within phagocyte. Dendritic cells (DCs) and microphages (M?s) play pivotal roles in innate immunity and adaptive immunity of host against Mtb. For identifying those secreted antigens with high potential promises in TB vaccines development, we propose to analyze the transcriptomes of Mtb H37Rv after infecting human DCs and M?s (downloaded from publicly available database BmG@Sbase), and retrieve the potentially secreted active (upregulated) gene signature (DMupS). The genes in DMupS will be overexpressed in E. coli and purified. Then, purified proteins will be used to stimulate peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) separated from whole blood of tuberculosis (TB), latent TB infection, and healthy volunteers. Then, cells will be processed for detecting the expression of Th1 cytokines (IFN-γ, IL-2, or TNF-α) in T cells subsets (CD4 or CD8) through flow cytometry. Further, those proteins with differed T cell responses among groups of donors will be used to immunize mice, and test their protective efficacy against Mtb. Successful accomplishment of this study will identify novel and effective T cell antigens suitable to be included in recombinant BCG or subunit vaccines development against Mtb.

目前，结核分枝杆菌(Mtb)免疫优势抗原主要来自Mtb体外培养液上清中的分泌性蛋白，而非Mtb在细胞内压力环境下特异性表达的蛋白，不能准确反映Mtb在体内诱导产生的免疫记忆及其功能。树突状细胞（DCs）和巨噬细胞（M?s）主要介导宿主抗Mtb的天然免疫和获得性免疫反应。为筛选更有效的TB新疫苗候选抗原，我们拟分析Mtb H37Rv感染人单核细胞衍生的DCs和M?s后的转录谱数据（下载自BmG@Sbase），并提取分泌性活化基因集（DMupS）。原核表达DMupS对应蛋白，并用其刺激结核（TB）病人、Mtb潜伏感染和健康志愿者外周血单个核细胞，并用多色流式细胞染色技术检测不同人群T细胞（CD4和CD8）表达Th1型细胞因子(IFN-γ、IL-2或TNF-α)的差异。并针对性的选择特异性T细胞抗原免疫小鼠，并分析其在小鼠TB模型中的免疫保护功能，为结核病新疫苗研究提供新颖且有效的T细胞抗原。

结核分枝杆菌（Mtb）免疫优势抗原主要来自Mtb体外培养液上清中的分泌性蛋白，而非Mtb在胞内压力下特异表达蛋白，不能准确反映Mtb在体内诱导产生的免疫记忆。树突状细胞（DCs）介导宿主抗Mtb的获得性免疫。为筛选更有效的TB疫苗候选抗原，我们分析了Mtb H37Rv感染人单核细胞衍生DCs后的转录谱数据（下载自BmG@Sbase），并提取分泌性活化基因集（MupDs）。原核表达MupDs对应蛋白，并用其刺激结核（TB）病人、Mtb潜伏感染（LTBI）和健康志愿者外周血，并测定血清中IFN-γ水平。我们鉴定出TB病人特异（Rv2006_1、Rv2006_2、Rv0244c_1、Rv2430c、Rv3841）、LTBI志愿者特异（Rv0244c_2、Rv2192c、Rv0824c）、TB病人和LTBI志愿者共有（Rv1845c、Rv2006_4）抗原。用TB病人和LTBI共有抗原免疫小鼠，结果发现免疫小鼠增强对于Mtb的免疫保护。该研究为全面鉴定这两个抗原在小鼠中对TB的免疫保护/治疗提供了数据支持。.我们分析了MupDs的MHCI/II高结合抗原表位，其为下一步全基因合成MHCI/II特异性抗原提供可能。.我们结合文献已发表数据分析了MupDs蛋白在H37Rv低氧诱导和复氧后的蛋白表达特征，发现其中5个蛋白在低氧诱导后下调（暗示和TB特异相关），9个蛋白低氧诱导后上调（暗示和LTBI特异相关）。该工作为TB/LTBI特异抗原的选择提供了参考。.我们分析了BCG或H37Rv感染小鼠脾细胞中MupDs特异性IFN-γ分泌细胞的比例。发现在感染后第3周H37Rv感染小鼠脾细胞含有高比例MupDs特异性IFN-γ分泌细胞。该现象和基于PPD的实验结果一致。该结果为进一步阐述宿主对于BCG和Mtb的免疫差异提供了数据支持。