肺组织内结核分枝杆菌抗原多肽疫苗保护效果的研究

Pulmoanry tuberculosis (TB) is a global infectious disease mainly caused by Mycobacterium tuberculosis (M.tb). Various prevent and control strategies are under developing, but still needs new breakthoughs. The present BCG vaccine does not prevent pulmonary TB in the adults population, developing new and efficacious Vaccine is the most urgent public health priority. This proposed study is to screen antigens directly in damaged lung tissue of TB patients. To dissect unknown antigens in lung, damaged lung tissues from TB patients was used to get chaperone-rich cell lysates by FS-IEF (Rotofor). We have proved that chaperone-rich cell lysates contained Hsp70 and Gp96 in TB patients with higher quantity which may carry different function peptides from the host and/or the bacterial. Peptides associated with chaparones were released and analyzed through LTQ technology. Currently, several Mycobaterium tuberculosis original peptides were identified and it shows at least one of them has function on activation of CD4+ and CD8+ T cells. Our findings may be beneficial to develop a more effective alternative of present BCG vaccine and provide candidates to post-exposure and therapeutic vaccines.

结核病是我国乃至世界范围内严重危害人民健康和国民经济的传染病，对其防控方法的研究意义重大。疫苗是预防传染病最有效和最经济的手段之一，而抗原是疫苗设计的关键问题之一。因此，本课题就围绕发现感染组织内功能性抗原这一科学问题，锁定筛选和验证结核分枝杆菌感染组织内的功能性抗原这一目标，借鉴病变组织内分子伴侣包含抗原多肽这一理论，利用液相等电点聚焦（Rotofor系统）浓缩分离分子伴侣、释放分子伴侣携带多肽，结合质谱分析以及免疫学技术等，以结核病患者结核性肉芽肿组织为研究对象，直接筛选具有应用潜力的功能性抗原（多肽/蛋白），为现有结核病疫苗尤其是感染后疫苗及治疗性疫苗提供基础实验数据。

尽管结核病是一个古老的疾病，但是结核病仍然是我国乃至世界范围内严重危害人民健康和国民经济的传染病，结核病的诊防治均未能突破目前存在的瓶颈技术障碍。因此，改变研究思路和研究策略，获得对结核病防控有支撑作用的研究结果意义重大。一直以来，利用免疫学方法寻找新的有效防控结核病的手段都是该领域研究的热点与重点。目前临床应用的结核病疫苗仅限于BCG，而其保护性有限且仅限于儿童。抗原是疫苗设计的关键问题之一，用于结核病疫苗研发或者诊断研发有效的结核分枝杆菌抗原仍然有限，其筛选研究也大多从病原体出发，而从宿主直接筛选抗原的研究鲜见。在前期课题探索并建立直接从肺组织筛选抗原表位的研究技术和有效研究结果支持下，本课题进一步利用分子伴侣-多肽复合物具有抗原特异性免疫功能的理论基础，通过Rotorfor等电聚焦电泳技术分离Hsp70- /Gp96-多肽复合物，结合LTQ Orbitrap Velos质谱分析技术等，通过与对照对比，直接寻找组织内免疫原性和抗原性强的候选功能抗原，一方面评估新型抗原的抗原性和免疫原性；另一方面针对前期从肺组织中筛选出且初步显示抗原潜力的新型结核分枝杆菌抗原PKA多肽，分别构建了PKA全蛋白（PKA）、PKA融合蛋白（EP1.2）、ESAT-6和CFP10 蛋白（已有商品化）以及各类对照蛋白等。利用酶联免疫斑点技术，通过临床样本验证，系统比较了新型抗原对病原学阳性（结核分枝杆菌DNA、痰涂片、痰培养三者至少有一项阳性）和病原学阴性（结核分枝杆菌DNA、痰涂片、痰培养三者均为阴性）结核病的辅助诊断潜力。目前已经通过收集的结核病患者169人（病原学阳性98人、病原学阴性71人）、正常人对照61人、以及肺炎等疾病对照24人等验证结果显示新型抗原PKA具有较强抗原性，与商品化抗原ESAT-6的阳性吻合率高达98%。其中，病原学阳性的结核病患者中PKA融合蛋白诊断特异性达77.05%，高于ESAT6单独抗原（73.81%）；其中，病原学阴性结核病患者的诊断特异性为73.77%，诊断阳性率高于ESAT-6。上述结果显示了PKA作为新型结核病抗原诊断标识的临床应用潜力。同时体内小鼠实验和体外患者细胞学实验均显示PKA较对照蛋白具有较强的免疫原性。本课题研究结果将为结核病辅助诊断、新型结核病疫苗的研制，尤其治疗性疫苗的研制提供有力且夯实的研究数据。