骨髓驻留记忆性T细胞的区域免疫特性及其在慢性免疫性血小板减少症中的作用研究

Immune thrombocytopenia (ITP) is an autoimmune-mediated thrombocytopenia syndrome characterized by increased platelet destruction / reduced platelet generation, and megakaryocyte maturation disorders or apoptosis abnormity. Bone marrow is an important site for immune response in ITP patients. In recent years, researchers have found that there are a large number of resident memory T cells (TRM) in the bone marrow. TRM can reside in the bone marrow for a long time and has important immunoregulatory functions. Regionally specific TRM in the bone marrow may constitute a pathological microenvironment by secreting inflammatory mediators, affecting the activity and function of immune cells such as bone marrow macrophages and dendritic cells, participating in the development of ITP, and it can be the main pathogenesis of chronic or refractory ITP. In this project, we intend to collect peripheral blood and bone marrow samples from clinical ITP patients, and construct transgenic mouse models and active ITP mouse models. In this study, we will use various molecular techniques (such as confocal microscopy imaging, mass spectrometry, single-cell RNA-Seq), to investigate the role and mechanism of bone marrow TRM in regulating bone marrow regional immune microenvironment in vitro and in vivo. Our research will explore interventions and provide new ideas for the treatment of ITP especially the treatment of chronic or refractory ITP.

免疫性血小板减少症（ITP）是一种以血小板破坏增多/生成减少、巨核细胞成熟障碍/凋亡异常为特点的自身免疫介导的血小板减少综合征，骨髓是ITP患者发生免疫应答的重要场所。近年来研究发现，骨髓中存在大量的驻留性记忆T细胞（TRM），TRM可长期驻留于骨髓中，具有重要的免疫调节功能。骨髓内区域特异性的TRM有可能通过分泌炎症介质、影响骨髓巨噬细胞和树突状细胞等免疫细胞的活性和功能，构成病理性微环境，参与ITP的发生发展，并可能是慢性或难治性ITP的重要发病机制。本项目中，我们拟收集临床ITP患者外周血及骨髓样本，同时构建转基因小鼠模型及主动型ITP小鼠模型，应用共聚焦成像技术、质谱流式、scRNA-seq等分子生物学实验手段，从体外和体内两方面探讨骨髓TRM调控骨髓区域免疫微环境的作用及机制，深入探索可能的干预措施，为ITP尤其是慢性或难治性ITP的治疗提供新的思路。

项目背景：免疫性血小板减少症（ITP）是一种自身免疫介导的血小板减少综合征，其特征是血小板破坏增加/血小板生成减少。骨髓（BM）是ITP患者发生免疫应答的重要器官。近年来的研究表明，骨髓中存在大量的驻留记忆T细胞（TRM）。BM中区域特异性TRM可能通过分泌炎症介质参与ITP的发生发展，影响BM巨核细胞和B细胞的活性和功能。研究内容：1）收集ITP患者及健康供者临床样本，检测骨髓TRM比例及功能。2）收集ITP患者及健康供者骨髓TRM，与CD34细胞共培养，检测骨髓TRM对血小板生成的影响。3）收集ITP患者及健康供者骨髓TRM，进行RNA测序。4）将TRM与CD19共培养，检测骨髓TRM对体液免疫的影响。实验结果：与对照组相比，ITP患者骨髓中TRM的比例显著增加。RT-PCR结果显示，ITP患者TRM细胞中NLRP3、IL-1beta和TNF-alpha的表达水平升高，IL-10表达水平降低。ITP患者TRM水平与巨核细胞计数、血小板计数、抗血小板抗体、复发难治度无关，而激素敏感患者中TRM的比例高于非敏感患者。CD34+细胞与TRM共培养14天后，CD41+的比例没有显著差异；巨核细胞倍体检测显示≥4N倍性比例增加；地塞米松处理后，TRM促进巨核细胞多倍体产生的作用被抑制。TRM共培养组产生的血小板明显少于对照组；而TRM联合地塞米松治疗可促进血小板生成。巨核细胞凋亡实验显示，TRM抑制巨核细胞早期凋亡。RNA-seq检测到1929个差异表达基因，其中897个基因在ITP患者中表达上调，1032个表达下调。对上调基因的GO/KEGG分析显示，ITP患者的TRM细胞富集了与体液免疫反应相关通路中高表达的基因。因此，将BM CD19+ B细胞分别与TRM和非TRM记忆T细胞（TM）共培养。结果显示，TRM共培养组naiveB细胞比例下降，而记忆B细胞和浆细胞比例增加，提示TRM促进了记忆B细胞的分化。TRM共培养组B细胞IgG抗体浓度升高，提示与非TRM记忆T细胞相比，TRM可促进B细胞产生抗体。结论：我们的研究发现BM TRM可能通过分泌炎性因子来影响免疫环境、促进巨核细胞倍体形成、抑制巨核细胞凋亡、促进体液免疫，从而参与ITP的发生发展。