糖尿病心肌病中硝化蛋白的鉴别和分析

糖尿病引发的慢性心血管病是导致糖尿病患者死亡的主要原因。很多研究已经证明糖尿病心肌病是由糖尿病引发的氧化和硝化作用直接相关的疾病，因为特异的酪氨酸残基的硝化会直接影响部分线粒体蛋白质的结构和功能，造成线粒体功能紊乱，导致糖尿病心肌病。但由于没有合适的动物模型，无法找到对发病起关键作用的特异性硝化蛋白。金属硫蛋白 (MT)是一种有效的抗氧化剂，它可以抑制心肌蛋白中的3－硝基酪氨酸的形成，并由此发挥预防糖尿病心肌病的发生和保护心脏的作用。本课题拟利用已经成功构建的心肌MT特异性高表达的转基因小鼠（MT-TG）STZ诱导的Ⅰ型糖尿病模型，结合蛋白质组学、免疫印迹、PCR等技术，探明MT在心肌病保护中的靶点蛋白；结合多种动物模型，找出具有普遍诊断和标记意义的共性蛋白，为糖尿病心肌病的诊断、防治提供新的思路。

实验总结：.糖尿病心肌病是糖尿病患者主要的心血管并发症，也是糖尿病患者死亡的主要原因,在糖尿病人群既存在着心肌坏死，也存在较高数量的心肌细胞凋亡。越来越多的证据表明，活性氧与活性氮引起的损伤在介导糖尿病心血管并发症的病理过程中起着重要的作用，活性氮的主要损伤作用是引起蛋白质的硝基化。从一定角度上，硝基化蛋白质的检测可以用来反映糖尿病心血管并发症的发生和发展。.本研究从蛋白质组学角度，着重于蛋白质硝基化的变化，探讨不同病程的糖尿病小鼠心脏中蛋白质的硝基化改变。同时，借助金属硫蛋白转基因小鼠研究金属硫蛋白的抗氧化作用对糖尿病心肌病的保护。鉴定发生硝基化的蛋白质，筛选关键目标蛋白质，深入研究其功能改变，为糖尿病心肌病的诊断、治疗提供借鉴。.实验中对FVB和金属硫蛋白转基因（0周、2周、4周、8周）小鼠，分别进行心脏标本采集，进行了组织学观察、硝基化蛋白研究和质谱检测。结果发现糖尿病心脏组织发生了病理性改变，出现细胞核皱缩，胶原纤维增生，金属硫蛋白可抑制纤维增生的发生。超氧阴离子检测结果显示，随糖尿病病程加剧，超氧阴离子生成增多，金属硫蛋白可抑制超氧阴离子生成。质谱法对酪氨酸硝基化的研究发现，糖尿病可诱导3-NT的生成。同时质谱鉴定出两种发生硝基化的蛋白质为琥珀酰辅酶A：3-酮酰辅酶转移酶（SCOT）和ATP合成酶，发生硝基化后，其活性下降，表达量则未出现补偿性增多。.在SCOT中，发生硝基化位点Tyr76、Trp374位于SCOT的活性位点处，Trp374在MT糖尿病小鼠中的硝基化程度显著低于WT糖尿病小鼠，此结论说明MT保护了Trp374的硝基化，从而保护了SCOT的活性。在ATP合成酶α和β亚基中检测到的硝基化位点分别为Tyr271、Tyr311、Tyr476和Tyr269、Tyr508，MT抑制了硝基化保护了ATP合成酶的活性。.通过本实验可以得出以下结论：糖尿病能增加体内超氧阴离子的生成，通过使SCOT和ATP合成酶发生硝基化以降低其活性，引起病变。金属硫蛋白降低体内氧化应激的产生，可通过抑制蛋白的硝基化起到对糖尿病心肌病的保护作用。 .成果：本项目已发表SCI论文6篇，另外1篇SCI论文处于revision状态，也极有可能被录用。同时获授权专利2项，培养博士研究生2名，硕士研究生3名。.综上所述，本项目基本完成了课题规定的任务。