金属硫蛋白对糖尿病心肌中ATP合成酶硝化应激的调控作用

Oxidative and nitrative stress plays a critical role in the occurrence of diabetic cardiomyopathy (DC), which is the direct factor for myocardial damage. Metallothionein (MT) as a non-specific antioxidant, significantly protects nitration damage, and improves myocardial morphology and function. However, the mechanism of signal transmission and network regulation of this process still remains unknown. Previous proteomics studies of the STZ-induced diabetic mice (cardiac-specifically overexpressed of MT), showed that MT obviously inhibited diabetes-induced 3-NT generation of ATP synthase α and β subunits in the heart. Moreover, ATP synthase is a critical enzyme for numerous metabolic pathways in organism, and one of the most important factors in maintaining normal myocardial function, which suggest MT may regulate the nitration level of ATP synthase to improve cardiac energy supply, reduce myocardial apoptosis and prevent DC. The purpose of this project is to take further research on how MT regulates the 3-NT site of ATP synthase. Vitro expression and site-directed mutagenesis techniques will be introduced to detect the influence of each 3-NT site on the activity of ATP synthase, which expect to explore the relationship between the protection mechanism of MT on DC and nitration damage. The achievement of this subject will not only provide a theoretical basis for clinical application but also expect to exploit a new method for the diagnosis of DC.

氧化硝化损伤在糖尿病心肌病（DC）发病过程中扮演重要的角色，非特异性抗氧化分子金属硫蛋白（MT）可显著抑制氧化硝化诱导的DC，但MT对DC作用的信号传递和网络调控机制尚不清楚。前期通过蛋白质组学技术对心肌MT特异高表达的糖尿病小鼠研究发现，MT可显著抑制心肌ATP合成酶α亚基和β亚基的硝化水平，而ATP合成酶又是生物体内能量代谢的关键酶，是维持心肌正常生理功能的必要因素之一，提示MT可能是通过调控ATP合成酶的硝化水平，改善心肌的能量供应，从而减少心肌细胞的凋亡，发挥其对DC的保护作用。本课题旨在前期实验基础上进一步研究MT对糖尿病心肌中ATP合成酶硝基化修饰酪氨酸位点的调控，并通过体外表达和定点突变技术检测各酪氨酸硝基化修饰位点对ATP合成酶活性的影响，以期深入探索MT对DC保护机制与硝化损伤的关系。本项研究结果不仅能在理论上指导临床，而且有望开辟DC诊断方法的新篇章。

糖尿病导致的慢性心血管病已经成为最危险的疾病之一。糖尿病心肌病是一种和糖尿病引发的氧化硝基化作用直接相关的疾病，是导致糖尿病患者死亡的主要原因。因此，预防糖尿病性心肌病显得十分迫切。ATP合成酶是生物体内能量代谢的关键酶，是天然存在的分子旋转马达，为细胞生命活动提供所需能量，在生命体中具有重要作用，翻译后修饰可改变蛋白的物理、化学性质、影响生物学活性，并调控许多生物反应过程，在某些病理情况下，ATP合成酶发生异常的翻译后修饰，导致机体损伤。金属硫蛋白（MT）是对多种重金属具有亲和力，富含半胱氨酸的短肽，是目前所知的最有效的自由基清除剂，MT-TG小鼠模型为在分子、生化和病理生理水平研究心肌MT蛋白开创了一条新的途径。.实验结果显示：（1）MT可抑制糖尿病导致的ATP合成酶硝基化，心肌超氧阴离子在MT-TG小鼠中明显减少，同时ATP合成酶的迁移减少，硝基化程度和位点被抑制。WT糖尿病小鼠心肌蛋白检测到硝基化位点为ATP合成酶α亚基Tyr271、Tyr311、和Tyr476，ATP合成酶β亚基Tyr269和 Tyr508。（2）运用紫外分光光度法检测ATP合成酶的活性，结果显示糖尿病组ATP合成酶的活性下降约32%，表明MT可保护ATP合成酶的活性。（3）糖尿病 WT和MT-TG小鼠造模8周后，提取心肌蛋白，运用高效液相色谱法检测ATP、AMP、ADP的相对含量，根据能荷公式测定能荷，结果显示糖尿病组心肌能荷明显下降，而MT转基因组没有明显变化，表明MT可维持心肌能荷。（4）补充Zn可以诱导MT的表达，并产生和MT基因转入一样的效果，可抑制ATP合成酶的硝基化、保护ATP合成酶的活性、抑制蛋白等电点的迁移、维持心肌能荷。.成果：本项目已发表SCI论文3篇，培养硕士研究生3名。综上所述，本项目已完成了课题规定的任务。