表达猪乳铁蛋白重组乳杆菌的构建及其生物学功能研究

本研究为2009年度主任基金的接续研究。前期获得了以分泌形式表达猪乳铁蛋白N端基因的重组乳杆菌，表达的重组猪乳铁蛋白具有一定的抑菌活性，可以进一步研究应用于生产实践。在本研究中，将构建以分泌形式表达猪乳铁蛋白全基因的重组乳杆菌，获得猪乳铁蛋白在乳杆菌中的高效表达，检测其抑菌活性以及在猪体内的定植（存留）能力；并与已表达猪乳铁蛋白N端基因的重组乳杆菌进行各项功能比较，将表达猪乳铁蛋白基因的重组乳杆菌进行仔猪体内的抗菌、抗病毒和免疫调节以及促进断乳仔猪健康生长等生物学功能进行研究，为表达猪乳铁蛋白的重组乳酸菌应用于生产实践提供理论依据。重组猪乳铁蛋白将能替代或部分替代抗生素，达到能明显增强仔猪免疫功能、改善断乳仔猪肠道菌群、降低断乳仔猪腹泻率和死亡率以及促进生长的效果。本研究将获得的重组猪乳铁蛋白，以活菌制剂作为饲料添加剂的可行性进行探讨，为基因工程乳铁蛋白的生产开辟新途径。

乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）是一种多功能的糖蛋白，它参与铁的转运，调节免疫系统，具有抗微生物、抗氧化和抗应激活性等；乳铁蛋白对于铁需求低的乳酸菌基本不抑制，且能促进动物肠道中双歧杆菌和乳酸杆菌等有益菌群生长；作为载体传递系统的乳杆菌是一种益生菌，国内外许多研究结果表明其可作为一种理想的表达细胞，具有目前所知的其他真核或原核生物无法媲美的优越性。本研究构建了以分泌形式表达猪乳铁蛋白全基因的四种重组乳杆菌，首先获得2016bp的猪乳铁蛋白（pLF)目的基因，将其克隆到乳杆菌表达载体pPG612.1的Xho Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切位点上，获得了PLF乳杆菌表达载体质粒pPG612.1-pLF。将获得的重组质粒分别电转化入干酪乳杆菌ATCC393、戊糖乳杆菌KLDS1.0413、植物乳杆菌KLDS1.0344和副干酪乳杆菌KLDS1.0652细胞内，获得四种表达猪乳铁蛋白的重组乳杆菌。通过Western blot和激光共聚焦检测重组猪乳铁蛋白的表达，用ELISA方法检测和比较四种重组菌上清中表达猪乳铁蛋白的量，并用琼脂孔穴扩散抑菌法检测四种重组乳杆菌表达乳铁蛋白的抑菌活性。以小鼠为实验动物模型，对四种重组乳杆菌以不同的组合饲喂小鼠,检测其对小鼠生长发育，肠道微生态和免疫功能的影响，以及体内抗菌研究；并对表达猪乳铁蛋白基因的重组乳杆菌进行仔猪体内的抗菌、抗病毒和免疫调节以及促进断乳仔猪生长发育，维护肠道微生态，促进小肠绒毛健康发育等生物学功能进行研究，为表达猪乳铁蛋白的重组乳酸菌应用于生产实践提供理论依据。结果表明，乳铁蛋白在四种重组乳杆菌中均得到正确表达，重组猪乳铁蛋白对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，鼠伤寒沙门氏菌，巴氏杆菌和李氏杆菌均有一定的抑菌作用。重组猪乳铁蛋白将能替代或部分替代抗生素，达到能促进小鼠生长发育，改善小鼠肠道微生态健康，降低小鼠被细菌和病毒感染率和死亡率；并且能明显增强仔猪免疫功能、改善断乳仔猪肠道菌群、降低断乳仔猪腹泻率和死亡率以及促进生长的效果。本研究将获得的重组猪乳铁蛋白，以活菌制剂作为饲料添加剂的可行性进行探讨，为基因工程乳铁蛋白的生产开辟新途径。