象耳豆根结线虫诱导的番茄转录组分析及根结特异表达基因启动子克隆

Root-knot nematodes (Meloidogyne spp.) are a diverse group of obligate plant parasites. They are the most economically important plant pathogenic nematodes and distributed worldwide. Among them, because of its ability to overcome all plant resistance genes, M. enterolobii was regarded as one of the most destructive species. In the fields of root-knot nematodes disease management, allowing plant to acquire resistance genes by means of techniques of genetic engineering is a promising way to against root knot nematodes . However, lacking of suitable gene promoters is an important restrictive factor to plant genetic resistance breeding for root-knot nematode control. Thus, based on the interactions of M. enterolobii and Lycopersicon esculentum, the analysis of tomato gene expression profile during the induced by infecting of root knot nematodes will be conducted in this study by using RNA-Seq. The genes that highly specific expressing in galls or giant cells of infected tomato root system will be screened. Then the gene promoter regions of selected genes will be cloned through sequence alignment with genomic information of tomato, and confirmed by genetic transformation of promoter region-report gene combination in planta.

根结线虫（Meloidogyne spp．）是植物病原线虫中种类最多、分布最广和危害最严重的一类线虫，其中强致病性种类象耳豆根结线虫（M. enterolobii）能克服抗病基因。在根结线虫防治领域，通过基因工程手段使植物获得对根结线虫的抗性是根结线虫病防治的有效途径，但合适基因启动子的缺乏一直是抗根结线虫转基因育种中的制约因素。因此，本研究将以象耳豆根结线虫（M.enterolobii）-番茄（Lycopersicon esculentum）的互作作为研究对象，通过转录组测序技术分析受根结线虫侵染后寄主的基因表达谱变化，筛选其中在根结特别是在巨型细胞中特异表达的高丰度基因， 获得基因全序列，通过与基因组信息比对，克隆基因5'端上游的启动子区域，将该启动子区片段与报告基因连接转化植物验证其启动子功能。最终获得可用于转基因抗根结线虫病育种的高效根结特异表达启动子。

根结线虫（Meloidogyne spp．）是植物病原线虫中种类最多、分布最广和危害最严重的一类线虫，其中强致病性种类象耳豆根结线虫（M. enterolobii）能克服目前抑制的所有自然界存在抗根结线虫病基因。在根结线虫防治领域，通过基因工程手段使植物获得对根结线虫的抗性是根结线虫病防治的有效途径，但合适基因启动子的缺乏一直是抗根结线虫转基因育种中的制约因素。为此，本项目主要致力于寻找能够被象耳豆根结线虫侵染所诱导在根结线虫的侵入部位特异表达的基因启动子并加以利用。取得以下成果：.1. 对接种象耳豆根结线虫21d的番茄地上部、地下部和未接种番茄的地下部进行转录组测序，发现36个基因在感病番茄地下部上调差异表达。通过Real-time PCR确认了其中的3个基因T2193，T106和S8780的表达动态与病程相符。.2. 使用PlantCARE对T2193，T106和S8780基因的启动子进行预测，根据预测结果克隆了3个基因的启动子片段，命名为PT2193-P、 T106-和S8780-P，分别将3个基因启动子片段插入pCambia1304载体，替换35S启动子，重组载体转入农杆菌菌株EHA105转化番茄。经过对转基因植株的检测发现T106-P启动子可以启动GUS报告基因在根结线虫侵染形成的根结中高效特异性表达。.3. 将T106-P启动子与来自苏云金杆菌的线虫毒性蛋白基因cry6A相连构建植物转化载体，通过农杆菌介导转入番茄和烟草，在获得转基因植株中T106-P启动子均能启动cry6A基因在根结线虫侵入部位特异表达，从而使转基因植株获得了对象耳豆根结线虫较高的抗性，相对防效超过70%。.4. 对象耳豆根结线虫侵染态与非侵染态的进行转录组测序以及基因定量检测，发现了线虫的分泌蛋白c80008、c80475、c82668、 c79855和c80502基因的表达量随线虫的寄生程度加深而增加。体外转录上述4个基因的干扰性dsRNA片段对象耳豆根结线虫的选致病基因进行处理，线虫的致病力和繁殖均有不同程度下降；选择干扰效果最好的c79855基因构建表达干扰性dsRNA片段的基因与T106-P启动子连接转化烟草，获得的转基因植株可以对侵入象耳豆根结线虫的目标致病基因产生50%以上的沉默效果，从而使转基因植株获得对象耳豆根结线虫的较好抗性，相对防效达57.1%。