象耳豆根结线虫新效应子基因Me-3C06的鉴定与功能研究

Meloidogyne enterolobii is one of the most damaging root-knot nematode species due to its wide host range, pathogenicity and ability to develop and reproduce on several crops carrying resistance genes. Effector proteins, which are secreted by root-knot nematodes during plant parasitism, have been demonstrated to play a key role in suppressing plant's defence responses, altering plant signalling pathways and inducing the formation of giant cells. Therefore , identifing and studying the function of these effectors are extremely important for understanding the molecular mechanisms involved in nematode parasitism and pathogenicity. Me-3C06 is a novel candidate effector gene that screened from a differential cDNA library of M.enterolobii juveniles. It has been noted that Me-3C06 shares no similarity with known genes in other organisms, and update its function is still unknown yet. In the present study, we will use a series of techniques and methods including real-time PCR, overexpression, subcellular localization immunohistochemistry and RNAi to investigate the gene's expression pattern and function. Afterwards, we expected that the research results obtained from this project would be very useful for deeper elucidating the molecular mechanism of parasitism and pathogenesis of M.enterolobii. Thus, the expremental information resulted from the study will be very possible as an excellent step to screen suitable genes,such as RNAi target initially.. .

象耳豆根结线虫寄主范围广、致病力强以及能在携带Mi抗性基因的作物上寄生繁殖，是最具危害性的病原根结线虫种类之一。研究表明，根结线虫在寄生过程中分泌的效应子在抑制植物防御反应，调节植物信号转导途径和诱导巨型细胞形成等寄生过程中起关键作用。因此，鉴定效应子并研究其功能是解析根结线虫寄生致病分子机制的重要基础。Me-3C06 是我们从象耳豆根结线虫寄生早期幼虫差异性cDNA文库中筛选到的一个新候选效应子基因，其功能未知并且与已知的其他物种序列无相似性。本研究拟通过发育表达模式分析、免疫组织定位分析、亚细胞定位、过表达以及RNAi等分子生物学手段，研究鉴定Me-3C06的分泌时间和位点，并分析验证其在象耳豆根结线虫寄生致病过程中的功能地位。本研究结果将为阐明象耳豆根结线虫的分子寄生致病机制提供新视角以及重要数据，并将可能为防治象耳豆根结线虫提供RNAi候选靶标基因。

象耳豆根结线虫Meloidogyne enterolobii 是我国华南热区重要的病原根结线虫种类之一，更是海南冬季蔬菜上的优势种，具有寄主范围广和毒性大的特点，可导致蔬菜和果树等多种作物的严重减产。然而，有关象耳豆根结线虫的分子致病机制研究还处于初始阶段，极大的限制了新的防治策略的提出。研究表明，根结线虫在寄生过程中分泌的效应子在抑制植物防御反应，调节植物信号转导途径和诱导巨型细胞形成等寄生过程中起关键作用。因此，鉴定效应子并研究其功能是解析根结线虫寄生致病分子机制的重要基础。在国家自然科学基金的资助下，本研究成功克隆了象耳豆根结线虫的一个新效应子基因Me-3C06。Me-3C06 cDNA全长为1313bp （不包含PolyA 尾巴），开放阅读框987bp, 5’非编码区57bp，3’非编码区269bp，开放阅读框推导编码328个氨基酸。Me-3C06 gDNA序列全长为1554 bp，共含有4个内含子，长度分别为72、83、45、41bp，均符合GT-AG剪切法则。Me-3C06 cDNA和gDNA序列均在NCBI GenBank中提交，登录号分别为KY386298和KY386299。Southern blot表明Me-3C06在基因组中存在且具有多拷贝，属多基因家族成员。进一步利用原位杂交、亚细胞定位、荧光定量PCR、瞬时表达和RNA干扰等多种分子生物学技术对Me-3C06进行了表达特征和功能研究，获得了Me-3C06 基因发育表达类型，确定Me-3C06在食道腺细胞特异表达，并且主要在寄生早期阶段表达；明确了ME-3C06蛋白的亚细胞定位位点及过敏性反应，验证Me-3C06瞬时表达可以诱导烟草细胞死亡；结合活体外RNA干扰和VIGS介导的植物体内RNA干扰技术，诱导了Me-3C06基因下调表达，对象耳豆根结线虫的致病能力产生了显著影响，导致象耳豆根结线虫诱导番茄根系病情指数相比对照下降约46%，研究结果揭示了 Me-3C06 效应子蛋白在寄生致病过程中具有重要的功能地位，推测其在寄生早期阶段参与抑制寄主防御反应过程和诱导取食细胞形成；已发表基金标注的期刊论文2 篇，会议论文摘要2篇，另外1篇SCI论文正在撰稿中。