基于大规模优化的头孢类抗生素合成酶催化剂的计算设计

In this project, the computer-aided de novo design methodology for enzyme molecular catalyst will be developed based on large-scale optimization and the transition-state theory for enzyme catalysis, and this strategy will be evaluated by the discovery of novel synthases which catalyze the synthetic reaction of 7-aminodesacetoxy cephalosporanic acid (7-ADCA) with D-dihydrophenylglycine methyl ester (DHME) to produce the important antibiotics cephradine. The key research contents include: (i) Propose de novo design catalytic motif for cephradine synthesis and develop combinatorial optimization algorithm to screen suitable scaffolds from protein database to anchor the complex active site model for cephradine synthetic reaction; (ii) Develop amino acid sequence global optimization strategy at acyl donor binding sites based on stabilizing the transition state for hydrolytic reaction of DHME; (iii) Develop amino acid sequence multi-objective optimization straegy at nuceophile binding sites based on the near attack conformation (NAC) structures which are constructed from the diffusion of 7-ADCA and the formation of transition state of cephradine. The large-scale optimization based enzyme design strategy established for cephradine synthesis can be extended into the enzyme discovery for the synthesis of other cephalosporin antibiotics to develop green processes for their preparation in pharmaceutical industry.

本课题将以大规模优化及酶催化的过渡态理论为基础建立计算机辅助的酶分子从头设计策略，并以头孢拉定合成酶的设计为例进行模型计算及实验验证。本课题在具体的建模过程中将重点研究：（i）提出头孢拉定合成酶从头设计的催化模式及开发组合优化算法从蛋白质结构数据库中筛选适合安装头孢拉定合成反应活性位点模型的骨架；（ii）以稳定酰基供体二氢苯甘氨酸甲酯（DHME）的水解反应过渡态为基础建立DHME结合位点处的氨基酸序列全局优化策略；（iii）以亲核试剂7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸（7-ADCA）的扩散及头孢拉定反应过渡态的形成过程中的近攻态结构模型为基础建立7-ADCA结合位点处的氨基酸序列多目标优化策略。本课题基于大规模优化建立的头孢拉定合成酶的从头设计策略可以推广到一系列头孢类抗生素药物的合成中，为抗生素药物的制备过程开发绿色工艺，从而为我们从源头上治理制药工业的环境污染问题创造条件。

设计催化非天然反应的新酶分子需要在惰性蛋白骨架上同时引入大量的突变才能实现，这对现有的方法包括定向进化依然是极大的挑战。本课题主要是开发新酶分子从头设计的计算方法以及其在设计催化三代头孢药物合成及其它重要化合物合成方面的应用。具体的研究成果包括：（1）开发了快速、准确的活性位点匹配算法，匹配精度达到亚埃，匹配速度达到可以在合理的时间内搜索整个蛋白质结构数据库；（2）通过在一个惰性蛋白骨架上同时引入17个突变从头设计了催化Kemp消除反应的新酶分子，并通过了实验验证；（3）开发了高通量分子动力学模拟辅助的计算酶设计方法，设计了比当前活性最高的Kemp消除人工酶活性进一步提高55%的新酶分子；（4）基于自主开发的计算酶设计平台PRODA开发了一系列催化三代头孢药物合成的新酶分子，实现了通过动力学控制的方法在水相中合成了三代头孢代表性药物头孢唑肟；（5）针对头孢唑啉的酶法合成设计了合成水解比大幅提高的新酶分子，在此基础上制备的固定化酶可以在较低的侧链比下实现头孢唑啉酶法合成的收率超过90%；（6）改造了催化甜菊糖苷合成的糖苷转移酶，设计了催化活性提高2.18倍的合成莱鲍迪甙D的新酶分子。本课题开发的计算酶设计方法可推广到其它重要化合物的生物合成，从而实现绿色合成，大大减少化工过程不可生物降解废物的排放，为解决我国目前面临的严重的环境危机带来机遇。