细胞自噬关键膜蛋白ATG9运输的分子调控

Atg9 is the only multispanning membrane protein among Atg family, which is essential for autophagy in yeast and mammals, highly conserved across species, and ubiquitously existed on multiple cellular membrane components such as plasma membrane, trans-Golgi network and endosomes. This protein has been thought to be involved in the supply of lipids for the formation of autophagosome. The most concern in the field of the research was how to regulate Atg9 trafficking and its contribution to autophagy in mammalian cells. We have identified two adaptor protein sorting signals at the N terminal of Atg9 which interacts with both AP1 and AP2 complex to mediate Atg9 trafficking. We also found that ULK1 kinase is able to directly phosphorylate Atg9 for its redistribution and autophagy initiation. We thus aim to identify the kinases and phosphatases targeting to Atg9 and understand how Atg9 phosphorylations are linked with Atg9 trafficking and autophagy initiation. Future studies will need to address the relationship between the different subpopulations of Atg9 and different kinases corporately regulating Atg9 phosphorylation. We also will focus on addressing the relation of ULK1 and other kinases phosphorylated Atg9 against cell death or senescence, and the possible roles in tumor formation in vivo. Our work will provide novel regulatory mechanism of Atg9 trafficking and autophagy initiation.

Atg9是至今已经发现的Atg家族蛋白中唯一的膜蛋白。研究发现Atg9蛋白主要定位于质膜、高尔基和胞内体，在细胞自噬体的起始和形成发挥关键作用，其分子调控机制尚不清楚。我们发现Atg9蛋白的N端有两个非常保守的adaptor protein分选信号，对Atg9的运输和细胞自噬调控具有重要的作用。磷酸化调控对Atg9的运输可能起着关键作用，同时质谱结果分析证明Atg9的N端存在保守的丝氨酸和酪氨酸磷酸化位点，初步结果表明激酶ULK1参与Atg9丝氨酸位点磷酸化调控。本申请主要鉴定Atg9蛋白的酪氨酸激酶和磷酸酶，分析磷酸化调控Atg9运输和细胞自噬的调控机制，以及不同激酶协同调控Atg9运输分子机制，同时探讨不同激酶调控Atg9的磷酸化对细胞命运的选择决定。

mATG9蛋白是酵母中ATG9蛋白在哺乳动物中的同源物，它是ATG蛋白家族中唯一一个膜蛋白。mATG9蛋白具有六个穿膜结构域，其N端和C端都暴露在胞浆中。前期研究工作发现，mATG9蛋白主要定位于反式高尔基，在饥饿刺激的条件下mTAG9从核周区域重定位到胞浆分布。mATG9蛋白还能够通过与AP2复合体相互作用介导其从质膜发生内吞出芽，通过初级内体定位到再循环内体，这一过程对于自噬体前体的形成和自噬的起始具有重要的作用。但是关于mATG9的分选机制和生理调控运输机制还不是很清楚。. 本项目首先发现并确定在mATG9蛋白的N端区域具有两个保守的接头蛋白分选信号，能够被AP1/2复合体识别从而介导mATG9膜泡的运输。而分选信号的突变体SS1/2能够抑制mATG9和AP复合体的相互作用从而导致mATG9蛋白在质膜上滞留。进一步我们通过质谱分析发现mATG9的运输能够受到磷酸化修饰的调控。通过体内外研究证实了激酶ULK1和Src分别调节mATG9的磷酸化进而参与自噬的调剂。发现在营养充分的条件下，激酶Src能够磷酸化mATG9蛋白N端的第8位酪氨酸，促进其与AP2复合体的相互作用，从而维持其持续的逆向运输以及核周定位。而用EBSS平衡盐溶液处理细胞诱导自噬发生，激酶ULK1能够增强和mATG9相互作用并磷酸化mATG9蛋白第14位的丝氨酸。同时研究发现了mATG9蛋白第8位和第14位丝氨酸的同时磷酸化能够显著增强其与AP1/2复合体的相互作用，促进其从反式高尔基和质膜上的出芽速率，进而促进自噬的发生。分选信号的突变体和第8位或者第14位磷酸化位点氨基酸的突变体能够一定程度的抑制EBSS诱导的自噬流量水平，证明了磷酸化修饰在调控mATG9蛋白运输以及自噬起始发生过程中的重要作用。. 综上所述，我们的研究发现了mATG9蛋白N端具有两个保守的分选信号，并且揭示了在不同营养条件下细胞能够通过磷酸化修饰mATG9蛋白的第8位酪氨酸和第14位丝氨酸调控mATG9膜泡运输以及自噬起始的分子机制。