ULK1复合体在哺乳动物细胞自噬中的调控与功能

Autophagy, a catabolic cellular process mediated by lysosomal activity and unique intracellular membrane trafficking and reorganization, is conserved in all eukaryotic cells and crucial for normal development and cell growth. Autophagy functions to degrade long-lived proteins and organelles in order to maintain cellular homeostasis and to promote survival under stressful conditions. Deregulation of autophagy is involved in multiple human diseases such as cancer and neurodegenerative disorders. Our long-term goal is to understand molecular basis, and the physiological and pathological function, of autophagy in mammalian cells. In this proposal, we will focus on ULK1, a protein kinase that mediates upstream signaling of mammalian autophagy. Recent work from our laboratory and other groups led to the discovery of two regulatory proteins of ULK1, ATG13 and FIP200. These proteins modulate the kinase activity and autophagy-induced subcellular translocation of ULK1; they also form a complex with ULK1. Based on our published and unpublished preliminary studies, we propose to investigate the regulation and autophagic function of the ULK1 complex by addressing the following questions: (1) how does the ULK1-Atg13-FIP200 complex mediate the signaling of mTOR, the major nutrient-sensing kinase whose activity is usually suppressed upon autophagy induction? (2) Whether and how does Atg13-FIP200 interaction regulate the autophagic function of ULK1? (3) How does the ULK1 complex relay the upstream autophagy signal to the downstream pathway? This project will utilize a combination of approaches including techniques of cell biology, molecular biology, biochemistry, chemical genetics, and imaging. Success of the proposed study will further our mechanistic understanding of mammalian autophagy, a cellular process critical for both normal physiology and various human diseases.

自噬是由细胞内膜运载所介导，由溶酶体融合及降解来完成的细胞异化代谢途径。它可降解胞质中高稳定蛋白，受损细胞器和外源物质, 对维持细胞稳态以及在应急状态下的生存至关重要。自噬的失调可能导致多种疾病，如癌症和神经退行性疾病等。我们的长期目标是阐明自噬的分子机制及其生物学和病理学功能。本项目着重研究哺乳动物细胞中介导自噬上游信号的蛋白激酶ULK1。近期我们发现了两个调控ULK1的蛋白：Atg13和FIP200，它们调节ULK1的激酶活性与亚细胞定位，并与ULK1一同组成ULK1复合体。本项目拟在上述进展基础上研究ULK1复合体在自噬途径中的功能。我们将从分子水平上解答如下问题：1）ULK1复合体如何介导主控细胞代谢的蛋白激酶mTOR的活性？2) Atg13和FIP200的相互作用如何调节ULK1的自噬功能？3) ULK1复合体如何调控自噬的下游分子事件？这项研究将进一步阐明自噬调控的分子机制。

项目变更说明.. 本面上项目原题目为“ULK1复合体在哺乳动物细胞自噬中的调控于功能”，后因申请人苏州大学姜学军教授特殊原因无法完成本项目，经协商，由苏州大学王建荣教授承担，项目内容调整为：“哺乳动物自噬关键蛋白Beclin1的新功能探究”。..一、研究目标和内容.（一）总体目标：阐明核Beclin1的新功能.（二）研究内容：.1）研究Beclin1核定位的规律：研究Beclin1核定位的特点和模式.2）研究Beclin1核定位的机制：主要鉴定Beclin1核定位必需的蛋白结构域.3）研究核内Beclin1的新功能：重点研究Beclin1在细胞衰老和分化中的作用.4）核Beclin1作用机制：主要鉴定核内与Beclin1相互作用的结合蛋白..本项目已完成了既定目标，具体成果如下：..1、发现随个体发育进程，Beclin1蛋白不断向细胞核迁移：本项目研究表明，Beclin1尽管也在胞质中分布，但主要存在于细胞核中；敲除该基因，自噬反应并不消失，表明Beclin1在细胞自噬中的作用是可以被替代的；个体出生后，Beclin1蛋白主要迁移至细胞核中。.2、确定了Beclin1蛋白分子中，40-50和254-266之间22个氨基酸序列对于Beclin1蛋白的核移位是必须的：运用连续突变法，确定了位于40-50之间的10个氨基酸序列，位于254-266之间的12个氨基酸序列是Beclin1蛋白入核必需的序列，确实其中任何一段序列，Beclin1就失去入核能力。.3、发现敲除Beclin1基因导致DNA损伤修复减弱：运用CRISPR/Cas9技术敲除Beclin1基因，发现导致DNA双链断裂损伤修复能力显著降低。.4、敲除Beclin1基因，自噬反应继续存在：Beclin1基因敲除后，自噬流继续存在，电镜下自噬小体、自噬溶酶体结构继续存在。.5、Beclin1调节DNA损伤修复不依赖于自噬机制：在破坏其它自噬基因的细胞中，Beclin1能促进DNA损伤修复，表明其对于DNA损伤修复的作用不依赖于细胞自噬途径。.6、Beclin1通过直接与DNA拓朴异构酶IIβ结合促进DNA损伤修复：用质谱等手段发现，在细胞核内，DNA拓朴异构酶IIβ与Beclin1结与Beclin1结合，使其定位到DNA损伤位点，参与DNA损伤修复。