生化解析哺乳动物细胞自噬体与溶酶体膜融合的调控机制

Our previous work revealed that ATG14 can promote mammalian autophagosome- lysosome membrane fusion driven by SYX17-SNAP29-VAMP8 complex, through membrane tethering and stabilizing SYX17-SNAP29 complex. Genetic knockdown of HOPS was also observed to inhibit the membrane fusion between autophagosomes and lysosomes in mammalian cells. Vps33, as one subunit of HOPS complex and a SM protein, might help assembling SYX17, SNAP29 and VAMP8 into a functional complex in mammalian autophagy. Here we hypothesize that HOPS and ATG14 synergistically promote the membrane fusion in mammalian autophagy. To test this hypothesis, we will reconstitute autophagosome and lysosome membrane system in vitro. We first aim to illuminate whether HOPS can promote the membrane fusion by specifically bridging autophagosomes and lysosomes, by assembling SYX17-SNAP29-VAMP8 complex, and by making this trans-SNARE complex to be resistant to NSF/αSNAP. We further aim to examine the potential synergistic effect between HOPS and ATG14. We will compare their membrane tethering capacity, individually and collectively. We will also test whether ATG14 can assist HOPS in assembling SNARE complex, as well as in protecting this complex from hydrolysis. In addition, we will investigate the recycling of SNARE complex and the trigging mechanism of autophagy membrane fusion. In summary, this study will help us understand the molecular mechanisms and guide us for future drug design.

ATG14可通过牵引膜及稳定tSNARE复合物加速SYX17-SNAP29-VAMP8驱动的哺乳动物细胞自噬体与溶酶体的膜融合。基因敲低另一膜牵引蛋白HOPS阻碍了该膜融合；且HOPS的组份之一Vps33作为SM蛋白家族的一员，可能具有组装哺乳动物自噬的SNARE复合物功能。据此我们推测 HOPS和ATG14协同促进自噬膜融合，并将在体外重组系统中验证。首先，我们将检验HOPS是否能够通过特异性桥连自噬体和溶酶体，组装SNARE复合物，以及保护该复合物抵抗NSF/αSNAP的水解以促进膜融合。进一步，我们将比较HOPS与ATG14单独及共同存在时的膜桥连效率，并检测ATG14能否协同HOPS促进SNARE复合物的组装和保护其抵抗水解，以阐明其协同作用机理。此外，我们也将对SNARE复合物的回收以及膜融合的启动途径进行探讨。综上，该研究将使我们更全面了解膜融合的调控机制，为药物研发奠定基础。

本项目聚焦自噬体-溶酶体融合的生化机制研究，利用体外重建的脂质体生化体系，重点研究了该过程中重要的调控蛋白包括HOPS，Rab GTPase等的分子机制。. 在哺乳动物中，HOPS对于晚期内体-溶酶体融合，以及自噬体-溶酶体融合非常重要。然而，虽然已有基因敲除的实验证实HOPS对于哺乳动物细胞中的自噬体-溶酶体融合至关重要，却一直缺乏体外的生化重组实验来证明这个假说。本项目利用了体外重组的脂质体生化体系，重建了由SNAREs蛋白，HOPS蛋白以及Rab GTPase共同调控的自噬体-溶酶体融合。我们发现成功的重组，需要HOPS复合物在修饰有正确活化的Rab GTPase脂质体膜上组装才可实现。不同于酵母，我们提出了HOPS组装的“hook-up”模型以实现膜牵引。只有当四元HOPS亚复合物和二元HOPS亚复合物分别与脂质体上活化的Rab39A，Rab2孵育，才可实现功能性六元HOPS复合物的组装，以实现膜桥连。也就是HOPS只有在Rab2和Rab39A之间才能完成正确的组装，而非Rab2与Rab7。组装后的HOPS可实现膜牵连，促进自噬SNAREs驱使的膜融合。Rab39A对于自噬的调控功能，也是在本项目的实施过程中发现和验证的。同时我们还发现Rab39A的活化可以稳定其定位于溶酶体/自噬溶酶体，并且招募HOPS到自噬膜上。. 综上，本项目研究发现，Rab39A作为一种新的调控细胞自噬的Rab GTPase，其活化对于在自噬体-溶酶体膜融合步骤招募HOPS有重要作用，通过体内外实验证明Rab39A-HOPS-Rab2复合体的组装促进了SNAREs介导的自噬体-溶酶体膜融合过程，为进一步解析自噬膜融合分子机制提供重要基础。