超长DNA序列体外简易高效扩增技术的研制

国内外尚无报道可以简易高效地扩增超长(50-100kb)DNA序列的技术。少量国际产品可以通过PCR扩增出来30-40kb的序列，但价格极其昂贵且扩增成功率未知。原因之一是国内外仍不完全清楚长片段扩增过程中的问题症结。症结之一是长片段DNA在热循环过程中DNA序列本身之间的非目标性相互配对程度较高,不同位置的序列之间热动力过程也难以协调一致,严重阻碍序列的有效延伸.近年来我们研制纳米基因扩增技术过程中体会到：纳米材料与DNA之间的相互作用可能使热循环过程中DNA结构的有序化程度增加，继而降低非特异性扩增程度或部分化解扩增困难。我们的初步数据表明,纳米碳管对长PCR（大于10kb）的增效作用十分明显。充分发挥纳米碳管的潜在模板作用并与其它有利于长PCR扩增的增效试剂充分组合起来,结合国际上最先进的长PCR技术之若干考虑点,很有可能催生低成本的高效稳定的超长PCR技术的诞生。

本项目基本完成了预定任务。主要成果是： （1）通过对77种碳纳米材料、常见的10种PCR增效剂（如乙二醇，1-2-丙二醇，海藻糖，DMSO，甜菜碱等）、2种金属纳米材料（纳米金，纳米银）、96种酵母细胞核内小分子的单因素筛选机双因素组合筛选以及少量多组合筛选【总共使用引物73对，含20对一般PCR引物，38对高GC扩增引物，15对长PCR引物。每种因素都通过58对引物扩增过滤，效果良好者20种因素进行两组合筛选，效果最好者再施以15对长PCR引物】，发现了6个PCR增效小分子，其中inosine, isoleucine和 uridine三组合可以有效扩增超过20kb DNA; (2)对超长PCR扩增中遇到的若干技术问题【延伸错配；DNA热变性复性的下带；脱嘌呤；聚合酶伙伴分子；诸因素之间协同效应等】有了更深入的认识；但是这些问题尚不能通过简单的添加纳米材料来解决；（3）在上述研究基础上我们提出了有效纳米化的概念，是指扩增反应成分与增效剂之间如果能够在微纳米尺寸内提供类似细胞核内天然的DNA复制环境，则DNA扩增效率应该可以继续提高。该设想指导我们在本项目中筛选一批细胞核内小分子并初步获得成功。（4）发表了5篇SCI文章，3篇EI检索文章，1篇核心期刊文章，申报了7个国家发明专利。项目期间上述7个专利及前期相关专利陆续获批，这样所涉及专利共有10项申报，获批共6项。