CFTR基因突变在汉族先天性输精管缺如中的机制研究

Congenital absence of vas deferens (CAVD) is a major cause of obstructive azoospermia and male infertility. Mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene (OMIM602421) are believed to be responsible for CAVD, but the functional mechanism still remains unclear. Few of the CFTR variants known in Caucasian has empirical evidence, as well as the key mutation locus of CFTR in Chinese CAVD is unknown. We have evaluated 19 Chinese patients diagnosed with CAVD, from whom the entire coding regions and splice sites of the CFTR gene were sequenced. A synthetic gene-to-protein computer work was used to ascertain that the novel mutation p.Thr1478Arg was detrimental to the disease. Base on this foundation, the entire coding regions and promotor region of reproductive relative genes of EDNRA, ENaC and 1L1B will be detected to find out the potential pathogenesis of Chinese CAVD patients. We also purpose to verify the function of the novel mutation using site-specific mutagenesistechnology, immunofluorescence, CHIP, EMSA and gene knockin technology, which is essential for determining the pathogenesis of CAVD in Chinese patients and providing the genetics consulting when assisted reproductive technique performed.

先天性输精管缺如（CAVD）是梗阻性无精症的重要病因。囊性纤维化跨膜转导调节因子（CFTR）是CAVD最重要致病基因，但其作用及机制仍有较多未明。高加索人种已知突变基因的功能验证仍有较多空白；汉族CFTR基因突变的关键位点至今未知。我们前期对汉族CAVD患者CFTR新突变Thr1478Arg等进行的蛋白模型预测显示该基因的明确致病性。课题组拟进一步对CFTR及相关修饰基因EDNRA、ENaC、1L1B行全外显子和启动子测序，探索CFTR突变在汉族CAVD患者中的关键位点及其他可能的致病位点。利用定点突变技术构建目的表达载体进行细胞株转染，免疫荧光检测表达蛋白定位，Chip、EMSA观察蛋白相互作用，基因敲入技术构建定向突变小鼠，对新发现突变位点进行功能验证，为CAVD的机制研究及对此类患者进行辅助生殖前遗传评估提供理论依据。

项目背景：先天性输精管缺如（CAVD）是梗阻性无精症的重要病因。囊性纤维化跨膜转导调节因子（CFTR）是CAVD最重要致病基因，但其作用及机制仍有较多未明。高加索人种已知突变基因的功能验证仍有较多空白；汉族CFTR基因突变的关键位点至今未知。.主要研究内容：本课题拟探索CFTR突变在汉族CAVD患者中的关键位点及其他可能的致病位点。对新发现突变位点进行功能验证，为CAVD的机制研究及对此类患者进行辅助生殖前遗传评估提供理论依据。.重要结果、关键数据及其科学意义：.1、收录了276名先天性输精管缺如患者（CAVD）和50例对照的资料及血样标本，并完成纤维囊性化跨膜转导调节因子（CFTR）基因的测序及比对。共找到了23个新突变位点，是汉族CFTR突变谱异于高加索人的有力证据。部分突变的生物信息学预测已完成，成果发表于生殖类权威杂志Fertil Steril。在基因的UTR区、外显子区和剪接区，共计鉴定出62种，336个突变，其中有82人检测出一个突变，101人检测出两个突变，17人检测出三个突变；实验结果有助于描绘汉族CFTR突变谱。.2、在CFTR启动子区域找到一个新突变c.-195C>A，并完成该突变基因的质粒表达载体构建。通过荧光素酶检测实验，证实该新突变显著下调CFTR蛋白的表达量，体外功能学验证了其致病性。研究成果已发表于基因类经典杂志GENE上。.3、CFTR基因Q1352H突变在患者组中拥有较高的检出率（11.59%），为亚洲人群特有。其位于NBD2功能域，已有研究证实该突变可以导致离子通道功能下降。提示Q1352H极有导致CBAVD的发生，且可能是中国人群的外显子突变中最重要的致病突变。阶段性研究成果已撰写入论文，现处于向国外期刊杂志投稿过程中。.4、发现一个CFTR基因内含子区域“5T”剪切突变家系，是突变基因遗传致病的有力证据，成果发表于国内著名期刊中华医学杂志并且于国内生殖年会上发表报告。.5、成功利用CRISPR/Cas系统敲入Q1352H突变，在构建突变型斑马鱼模型过程中发现杂交后所得的胚胎存在发育障碍，提示父系来源的遗传因素对早期胚胎发育可能具有重要作用。仍在进一步研究中。