角膜基质细胞重塑细胞外基质引导角膜新生血管形成的机制研究

Corneal neovascularization (CNV), a major cause of loss of vision and blindness in a wide range of corneal diseases worldwide, is an incompletely understood process that is also called sprouting angiogenesis explained by a traditional mechanism that underlies the secreting proteases, degrading basement membrane, invasion of surrounding stroma, migration, proliferation, and tube formation of vscular endothelial cells (VECs) stimulated by angiogenic factors. In the present study, we found that keratocytes could directly degrade extracellular matrix (ECM) to create spaces into which VECs could migrate. However, CNV did not occur although chicken corneas expressed markedly angiogenic factors and matrix metalloproteinases as same as mice corneas after alkali burns. It is necessary that keratocytes carve out stroma spaces and remodel ECM by the incompletely understood mechanism to allow for VECs invasion during CNV. This project will investigate this mechanism by comparison of the corneas of mouse and chicken treated with and without alkali burns using a series of experimental methods including quantitative RT-PCR, western blot, siRNA knock down, difference protein mass spectrum, DNA microarray and conditional transgenic mouse. The evidences from this study may be useful to design new drugs for clinical therapy of ocular neovascular disorders.

角膜新生血管是世界范围的致盲性角膜疾病，发病机制不清，被认为是血管内皮细胞受促血管内皮细胞生长因子的激活，分泌蛋白酶，以出芽方式，降解基底膜，侵入周围细胞外基质，迁移、增殖及构成新血管的过程。我们目前的研究发现，角膜基质细胞能直接降解细胞外基质，创造基质空间以利内皮细胞的长入。然而在碱烧伤后尽管鸡角膜有与小鼠角膜一样显著升高的促血管生长因子和基质金属蛋白酶表达，但并无新生血管的形成，表明角膜新生血管的形成需要角膜基质细胞重塑细胞外基质，创造基质空间才能引导血管内皮细胞的生长，但角膜基质细胞重塑细胞外基质的调控机制至今未清。本项目拟通过对比碱烧伤前后的小鼠和鸡角膜，利用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应、蛋白质印迹、小干扰核糖核酸、差异蛋白质谱、基因芯片分析及条件性转基因小鼠等方法，揭示角膜基质细胞重塑细胞外基质引导血管内皮细胞生长的调控机制，为新生血管性眼病治疗药物的研发提供新的线索和依据。

本课题的目的在于证明角膜新生血管的形成（CNV）是由于某种或某些细胞外基质（ECM）成分的表达发生变化，从而导致促CNV发生的基质重塑，这样的ECM成分表达的变化是受某种或某些已知的细胞因子及其受体或蛋白酶或信号通路蛋白、或未知基因的调控。我们通过Kera-Cre小鼠分别与mT/mG、转化生长因子β受体（TGFbr）2f/f、血管内皮细胞生长因子受体（VEGFr）2f/f 和VEGFr3f/f小鼠建立了转基因小鼠模型，研究了角膜基质细胞的类型及其在重塑ECM促进CNV中的分子机制，发现角膜基质细胞至少存在Kera+和Kera-两种类型，角膜损伤后Kera+ 角膜基质细胞不能迁移、增生和转分化为肌成纤维细胞，角膜基质细胞 TGFbr2而不是VEGFr2或VEGFr3基因的敲除会导致ECM异常而促进CNV。我们进一步研究了过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）a在角膜基质细胞重塑ECM促进CNV中的作用机制，发现PPARa的敲除或表达的抑制会通过上调VEGFr3和MMP-13的表达重塑ECM促进CNV。我们的研究揭示了TGFbr2和PPARa是与ECM重塑相关的细胞因子受体和转录因子。 我们也发现睡眠剥夺通过抑制PPARa的表达，进而下调TRPV6的表达及Ezrin的磷酸化，导致角膜上皮微绒毛形态的异常而引起小鼠干眼，揭示了睡眠剥夺诱导干眼发生的分子机制。我们也进行了以监测、流行病学和最终结果（SEER）数据库人群为基础的回顾性分析，调查了组织学亚型对鼻咽癌生存率及淋巴结分期对组织学亚型预后的影响，发现组织学在鼻咽癌 患者是独立的预后因素，而进展性淋巴结分期与角质化鳞状细胞癌较低的生存率无关，揭示了鼻咽癌预后与组织学亚型及淋巴结状态的相关性。