烟碱生物合成相关调控基因的筛选及功能解析

烟碱是烟草特有的、由根系合成的次生代谢产物，是影响烟叶质量的主要物质成分之一，也是生物农药、医药、生化试剂的重要原料。尽管过去有许多研究工作致力于对烟碱生物合成调控机制的探讨，但迄今仍不清楚烟碱生物合成的分子调控机理。烟株打顶后合成烟碱的能力显著增强，为研究烟碱生物合成调控机制提供了比较材料。本项目拟从已构建的打顶前、后烟株根尖组织差异表达文库，对EST 进行聚类、结构分析和功能预测；采用定量PCR、northern杂交等方法分析侯选基因在根系中的表达谱，并结合前期经差异蛋白质组学分析筛选出的蛋白质成分，筛选并克隆导致烟碱合成能力增强的候选目标基因。进一步转化烟草和BY2细胞，运用荧光免疫技术对筛选出的目标基因表达产物进行组织、细胞定位；结合生理生化分析，揭示烤烟打顶前、后根尖组织所发生的复杂代谢和功能变化。以期从分子水平解析烟碱生物合成的分子调控机制。

本项目利用SSH 技术构建了打顶前、后根尖组织差异表达文库，将差异明显的克隆测序得到的EST序列按功能分为：生物碱合成（4%）、激素代谢（3%）、信号转导和转录因子（18%）、胁迫和防御（32%）、蛋白质代谢（9%）、碳代谢（6%）、其它代谢（15%）、功能未知类（13%）。同时分别构建了打顶前后miRNA文库和数字基因表达文库，综合分析了三者之间的关系，为进一步研究打顶诱导烟碱合成能力增加的机制奠定了基础。. 采用打顶、不打顶、不打顶喷施JA、打顶后喷施NAA处理检测对根系发育和烟碱合成的影响。相对不打顶的烟株，打顶后根系生长明显发达，侧根增多；而不打顶喷洒MeJA根系发育稍微优势；打顶喷洒NAA的烟株根系表型差于打顶，优于不打顶；表明烟株打顶导致顶端优势消除，根系生长素含量增加，导致侧根数目增加，合成烟碱的部位增多；不打顶喷洒MeJA只诱导根系烟碱合成能力增强，对根系发育无明显影响。推测烟株打顶后，烟叶中烟碱含量增加既有根系量的增加，又有JA和IAA信号途径的交互作用。. 分析克隆的PMT1启动子序列，发现含有串联的W-box和激素响应的顺式作用元件，因此，从SSH库中筛选并克隆了与根系发育相关转录因子NtNAC-R1（打顶后高表达）和能与启动子上W-box结合的NtWRKY-R1转录因子（打顶后低表达）作为打顶伤害诱导烟碱生物合成增加的影响因子进行研究。NtNAC-R1在根中强烈表达，烟株打顶后6h开始升高；反义NtNAC-R1转化烟株中，PMT、ODC表达下调，进一步瞬时表达分析与JA和IAA信号途径相关的基因（PDF1.2，IAA13）表达量，两者都降低。表明NtNAC-R1不但调节根系的生长发育，而且也与IAA和JA信号途径对烟碱的生物合成调控有关；克隆的NtWRKY-R1转录因子属于WRKYII亚类，亚细胞定位在细胞核中，在根中强烈表达。烟草原生质体中瞬时表达分析发现，NtWRKY-R1促进NPR1表达，抑制PDF1.2表达，即NtWRKY-R1激活SA相关防御反应，抑制JA信号途径。更为重要的是NtWRKY-R1过表达可以抑制PMT表达，从而抑制烟碱生物合成。. 综上所述，该研究为分子水平解析伤害刺激诱导烟碱生物合成信号传导和网络调控奠定了基础。