S. avermitilis neau1069全基因组鉴定代谢杀虫剂多拉菌素调控基因及调控机理研究

The novel strain Streptomyces avermitilis neau1069 not only generates natural insecticide doramectin together with nine new secondary metabolites, but exhibits distinctive biosynthetic gene cluster and biosynthetic mechanism associated with doramectin production. The genome-wide identification of regulatory genes involved in doramectin biosynthesis will be conducted by transposon mutagenesis technology. Then, the most important two or three regulatory genes will be selected as targets to investigate their influences on the transcript abundance of genes in the biosynthetic gene cluster of doramectin. On the basis of the inner interaction of DNA-protein, the potent DNA sequences in the genome, which bind to the regulatory proteins will be identified by ChIP-Seq assay. Subsequently, the EMSAs and DNase I footprinting assays will be employed to determine the start binding positions in the DNA targets, leading to clarify the regulatory network of regulatory proteins and elucidate the regulatory mechanism by the regulatory genes in the biosynthesis of doramectin. This research will pave the way for constructing complex regulatory network of doramectin biosynthesis and developing genetically engineered strain with high yield of doramectin to resolve the practical problems encountered in doramectin production.

发现的新微生物S. avermitilis neau1069代谢天然产物杀虫剂多拉菌素和9个新结构化合物，并具有特异的生物合成多拉菌素基因簇和机理。拟利用链霉菌高效转座诱变技术，从源头系统、全面的在全基因组水平上，鉴定出影响多拉菌素生物合成的相关调控基因。并进一步研究影响多拉菌素生物合成最大的2-3个调控基因，明确它们对多拉菌素合成基因簇中基因的转录丰度影响；以及以调控基因编码的蛋白为核心，以DNA-protein相互作用为基础，通过ChIP-seq技术发现调节蛋白结合的靶序列，并从全基因组中找到调节蛋白的靶基因集，在靶基因集中采用凝胶阻滞(EMSA)及DNA足印技术寻找结合的起始位点，明确调节蛋白的调控网络模块，揭示调控基因对多拉菌素生物合成的调控机理。研究为构建多拉菌素生物合成的复杂调控网络奠定基础和数据累积，也为构建多拉菌素高产工程菌，解决多拉菌素生产实际需求问题奠定坚实理论基础。

阿维菌素是目前公认的生产量和使用量最大的微生物天然产物农药，在工业上由阿维链霉菌发酵产生。不断挖掘并适配影响阿维菌素产量的重要靶点有利于获得高效阿维链霉菌工业菌株。结合转座与高通量测序的Tn-Seq是追踪关键靶点的有效策略，然而，现有转座子致使该技术仅能追踪转座失活的基因，不能捕获因转录水平发生调整而使菌株产量提高的靶基因。为了获得更多重要基因，该研究在Tn5转座子的基础上，引入了pTNM和在链霉菌中能够显著提高插入靶点周边基因表达水平的转座子pUC19-TN。利用该转座子对出发菌株阿维链霉菌NEAU-XAV（2.3 g/L）进行转座突变，在391株突变菌株中，获得36株阿维菌素B1a产量稳定提高25%以上的菌株，以及76株产量显著下降75%以上的菌株。测序分析表明，上述112个突变菌株的转座靶点包括转录调控因子（9个）、转运蛋白（12个）、辅因子合成（3个）、以及初级代谢（23个）和次级代谢（12个）等相关基因。从中挑选对阿维菌株产素产生影响的转录调控因子靶点3个，分别为NEAU-XAVGM3771、8532、6031，在出发菌株中过表达分别使出发菌株产素提高了75%、43%和123%；转运蛋白1个，NEAU-XAVGM6565~6568，在出发菌株中过表达后使出发菌株产素提高了65%。该研究为提高阿维菌素类生物农药的产量提供了重要靶点；同时，也为提高其他链霉菌抗生素产量提供了新工具。