紫外线诱导海参自溶启动机理的研究

Sea cucumber is a kind of living things that possess strong autolysis capacity. The phenomenon of "spiting intestine, dissolution, melting skin" could appear especially sea cucumber is under ultraviolet (UV) irradiation. That takes a lot of inconvenience to the storage and processing of sea cucumbers. Previous study indicated that UV-induced sea cucumbers autolysis was mainly due to cathepsin (L and B) which present in the body of sea cucumber. However, there are something that presently have not been determined, such as the reasons of UV light as the external stimuli factors have led to the release of cathepsin, which signaling cascades happen before cathepsin release.To study these two issues, in the present project, we intend to reveal the molecular protein signaling expression at the molecular level before UV induced cathepsin release, then analysis the redox reactions that occurs in the body of sea cucumber. Firstly, molecular protein expression before UV induced cathepsin release will be analyzed using western blotting and determine cathepsin release of signaling pathways, secondly, the produced manner and type of reactive oxygen species (ROS) will be determined by electron spin resonance (ESR) techniques, finally, based on the test of fluorescence microscope and flow cytometry, the lysosomal permeability and rupture of sea cucumbers will be determined. The present project will establish the theoretical basis to reveal the initiated mechanism of sea cucumber autolysis.

海参是自溶能力很强的生物，特别是在受到紫外线的照射后，会出现"吐肠、溶解、化皮"的现象，给海参的贮藏与加工带来不便。研究发现紫外线诱导的海参自溶主要是由于存在于海参的组织蛋白酶（L和B）的作用。然而紫外线作为外界刺激因素导致组织蛋白酶释放的原因，组织蛋白酶释放前发生了哪些信号级联反应，目前尚未确定。针对这两个问题，本项目拟从分子水平上揭示紫外线诱导组织蛋白酶释放前发生的分子信号蛋白质表达，并分析海参体内发生的氧化还原反应。首先，应用免疫印迹技术分析紫外线诱导组织蛋白酶释放前发生的分子蛋白表达，确定组织蛋白酶释放的信号途径；其次应用电子自旋共振（ESR）技术确定活性氧（ROS）的产生方式和种类；最后根据荧光显微镜以及流式细胞仪分析试验，确定海参溶酶体的通透性与破裂，从而为揭示海参自溶启动机理奠定理论基础。

海参属棘皮动物门海参纲，具有极强的自溶能力，在外界环境及化学因子的刺激下， 海参首先发生“吐肠”，体壁部分发生溶解，甚至溶为液态。我国海参2014年产量已超过19万吨，种类主要为仿刺参（Stichopus japonicas）。自溶现象给海参的保鲜、贮藏、运输和加工带来诸多不便，造成极大的营养和经济损失。揭示海参自溶的机理，可为调控海参自溶过程提供抑制和激活的双向理论依据，具有明显的现实意义。.以鲜活刺参为对象，应用荧光酶标仪检测法、试剂盒检测法研究刺参在受到UV照射后，体内ROS水平的提升，作为氧化防御的抗氧化酶活力发生不同程度的变化，GSH含量增加，同时引起caspase-3激活，以蛋白质羰基为标志的氧化损伤以及CL、AChE活力的变化，从而确定了氧化应激参与了UVA诱导的刺参自溶。.以刺参为原料制备刺参体壁匀浆提取液，采用DMPO捕获剂与电子自旋共振（ESR）技术检测UVA诱导刺参ROS的产生以及相关试剂对UVA诱导ROS生成的影响。结果表明，UVA照射后，海参体壁匀浆液产生羟自由基（•OH）ESR信号，加入特异性抑制剂后，•OH的强度随着甘露醇、SOD和Catalase浓度增加而减弱，随着Mg2+、Ca2+浓度的增加而减弱，pH 7.0时•OH信号最稳定。表明UVA诱导刺参体壁匀浆液生成•OH的途径中，经由超氧阴离子转化为H2O2，进而生成羟基自由基，羟基自由基可能是UVA诱导刺参自溶的关键因素之一。.以鲜活刺参为研究对象，采用Western-blotting方法、DNA Ladder检测法，SDS-PAGE分析法等检测活刺参自溶前后相关指标的变化，结果表明，经过UVA不同时间照射后，p-p38的表达量随着照射时间的延长而增加，照射1h p-p38和p-JNK水平显著提高，p-ERK没有变化。说明刺参在UVA诱导的自溶启动过程中，p-p38作为上游的一条途径，对于后续相关蛋白表达以及介导伴随有细胞凋亡的海参自溶起到上游调控作用。刺参UVA照射1h后，室温放置24h过程中，发生明显的自溶损伤现象，caspase-3的比活力放置12h最高；同时刺参的DNA片段化与蛋白质降解程度随着放置时间的延长而增大。综上，UVA诱导刺参自溶的一条信号途径为UVA→ROS→MAPK激活→→Caspase-3激活→→刺参自溶，这一途径丰富了海参的自溶机理。