活性氧（ROS）介导的内源酶调控海参低温嫩化品质机理

Sea cucumber has important nutritional and economic value. Its special protein composition determines that the sea cucumber products have special textural characteristics. Low-temperature tenderization technology can improve product quality to a certain extent. However, the sea cucumber products can’t reach ideal quality when low-temperature tenderization is not sufficient. And sea cucumber products appear soft, melting phenomenon and loss commercial value when low-temperature tenderization is excessive. Accordingly, disclosure of sea cucumber quality mechanism during low-temperature tenderization can provide a theoretical basis of quality controlling for the regulated sea cucumber tenderization, it has obvious practical significance. The project intends to reveal the sea cucumber quality mechanism during low-temperature tenderization from the molecular level, to analysis the mechanism of oxidants formation, molecular protein expression as well as endogenous enzyme activation in sea cucumber. Firstly, ROS generation and its species will be determined using the electron spin resonance spectroscopy and flow cytometry-fluorescent probe detection technology combined with specific inhibitors. Secondly, molecular protein expression and endogenous enzymes changes will be analyzed using western-blotting, immunohistochemistry and other technology, and the signaling pathways activated by endogenous enzymes will be determined. Finally, the signaling pathways relations among ROS, protein molecules, endogenous enzymes and sea cucumber quality will be determined by the application specific inhibitor binding correlation detection techniques. It will lay a theoretical foundation for revealing sea cucumber quality mechanism during low-temperature tenderization.

海参具有重要的营养与经济价值，其特殊蛋白质组成决定海参产品具有特殊的质构特性，低温嫩化可以在一定程度上提升海参产品品质。然而低温嫩化不充分，产品达不到理想的品质，低温嫩化过度，又会出现软烂、融化现象，失去商品价值。因此，揭示海参低温嫩化品质机理，可为调控海参嫩化提供品质控制的理论依据，具有明显的现实意义。本项目拟从分子水平上揭示海参低温嫩化品质的作用机理，分析海参体内发生的氧化物生成机制、分子蛋白表达以及内源酶激活反应。首先，应用电子自旋共振波谱与流式细胞仪-荧光探针检测技术结合特异性抑制剂确定ROS的生成和种类；其次应用western-blotting、免疫组化等技术分析低温嫩化过程海参分子蛋白表达和内源酶的变化，确定内源酶激活的信号途径；最后应用特异性抑制剂结合相关检测技术确定ROS、分子蛋白、内源酶以及海参嫩化品质之间的信号通路关系，从而为揭示海参低温嫩化品质机理奠定一定的理论基础。

海参具有重要的营养与经济价值，其特殊蛋白质组成决定海参产品具有特殊的质构特性，低温嫩化可以在一定程度上提升海参产品品质。然而低温嫩化不充分，产品达不到理想的品质，低温嫩化过度，又会出现软烂、融化现象，失去商品价值。本研究项目从分子水平上研究解释海参低温嫩化品质的作用机理，分析海参体内发生的氧化物生成机制、分子蛋白表达以及内源酶激活反应。相关研究主要包括以下几方面内容：.（1）嫩化的微观表现为胶原纤维结构的破坏，即胶原蛋白的热变性温度降低、热溶解性提高，胶原原纤维不断从胶原纤维束中解离。通过研究水溶性蛋白的各级结构，发现蛋白的侧链羰基修饰、 游离巯基含量减少， 二级三级构象趋向不稳定转变，并发现自由基大量生成，反映了蛋白氧化的发生，证明了蛋白降解的发生。（2）海参体壁嫩化过程中， cathepsin L、 caspase-3 和 MMPs 的活力均有显著提高；在将胶原酶与不溶性蛋白或海参体壁组织共同作用时， 发现其降解后的蛋白分布模式与嫩化后海参体壁蛋白的降解模式一致。在半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的特异性抑制剂与海参体壁组织共同作用时，发现 3 种抑制剂均可不同程度地抑制结构蛋白降解。（3）以胶原纤维为模型，对其进行氧化、热处理以及二者共同作用，发现氧化和热处理均可导致蛋白、糖胺聚糖溶出，且氧化对蛋白聚糖有显著降解作用，可以导致胶原蛋白氧化，降低胶原蛋白的稳定性， 促使胶原原纤维的解聚。发现抗氧化剂 EGCG 可有效抑制热处理造成的蛋白聚糖和胶原蛋白的结构变化，提高胶原纤维的稳定性，表明了热处理对胶原纤维结构的破坏与氧化有关。（4）对嫩化后的海参体壁进行蛋白组和转录组分析，发现在 cathespins、 calpains、caspases、 proteasomes 和 MMPs 的蛋白表达量均显著上调， 而只有 MMP 2 和 MMP 16的基因表达量显著上调。对差异表达蛋白（DAPs）和差异表达基因（DEGs）进行生物信息分析，发现主要涉及氧化应激、固有免疫反应、细胞凋亡、细胞骨架蛋白和细胞外基质蛋白重组等生物学进程，且彼此间存在交互作用。