小黑杨矮化突变株插入位点的基因定位与功能分析

创造基因功能缺失突变体是研究目的基因功能的最直接和有效的途径之一，农杆菌介导的T-DNA插入不仅破坏了插入位点的基因功能，而且因为T-DNA序列已知，使得被破坏的基因序列的分离相对简单和快捷。因此该技术被广泛地用于功能基因的研究。.本项目以小黑杨矮化突变株dwf1为材料，通过TAIL-PCR的方法分离插入位点侧翼序列，克隆控制高生长性状的基因，构建该基因的植物组成型表达载体及RNA干涉载体，采用农杆菌介导法进行突变株dwf1及小黑杨（WT）的遗传转化，通过转基因株系的株高等表型性状分析，阐明该基因的功能。杨树是我国重要造林树种之一，高生长是其重要性状，高生长基因的发掘，对实现杨树的定向改良，培育速生新品种，提高杨树生产力具有重要的理论意义和应用价值。

以转基因小黑杨矮化突变株dwf1为材料，采用TAIL-PCR方法克隆插入位点的旁侧序列AP2/PthRAV（XM_002311402.1），荧光定量分析显示AP2/PthRAV的相对表达量在dwf1株系中显著高于其它转基因株系及野生型对照株系平均值的7.78倍，认为小黑杨矮化突变与 AP2/PthRAV基因相关。生物信息学分析表明：AP2/PthRAV是一种典型的转录因子，属于 AP2/EREBP 转录因子家族 RAV 类亚家族的一员，该序列包含一个1110bp的ORF阅读序列，编码369个氨基酸，蛋白质相对分子质量为4.14kD，该蛋白含有一个典型的 AP2 结构域和一个典型的 B3 结构域。采用高通量测序技术分析dwf1株系、2个表型正常的转基因株系及野生型小黑杨的基因表达，结果表明：dwf1具有完全不同于野生型以及其他转基因株系的基因表达模式。与野生型相比，dwf1中共有2163个差异表达基因，其中1264个为仅出现在dwf1中的差异表达基因，进一步分析发现，大量与光合作用相关基因发生差异表达，同时参与碳固定、淀粉及蔗糖代谢以及许多转录因子也发生了差异表达，这些差异表达的基因可以作为调控生长的候选基因。. 构建了35S:: AP2植物超达载体和35S:: amiR -AP2干扰表达载体，采用农杆菌介导法进行小黑杨的遗传转化，获得了3株35S:: amiR -AP2小黑杨转基因株系。实时荧光定量PCR检测结果表明：mRNA水平上AP2/PthRAV在非转基因对照及3个转基因小黑杨株系中均有表达，但3个35S:: amiR -AP2小黑杨的表达量显著下调，认为转基因小黑杨的AP2/PthRAV基因受到了不同程度的抑制。与非转基因对照比较转基因小黑杨根生长缓慢，认为小黑杨AP2/PthRAV基因可能参与调控根生长发育。