高通量鉴定T-DNA插入突变群体插入位点旁侧序列

Establishing a population with saturation of T-DNA insertions in plant genome and characterizing the sequence flanking the insertion is an important strategy for studies of functional genomics. To isolating sequence flanking the insertion and identify the mutated gene is time consuming and laborious by traditional methods. With rapidly progress of high throughput sequencing, identifying mutant site using this method will be a key technological breakthrough. Target-enrichment and sample treatment is a critical step before sequencing. We carried out a pilot study to investigate the feasibility of combing mutant site identification with high throughput sequencing employing a population of T-DNA insertion in Brachypodium. T-DNA flanking sequences are collected by two rounds of amplification using DNA pool of insertion lines as templates. The ligated adapters of pooled DNA are designed asymmetrically and a serials of specific primers are compatible with the primers for high throughput sequencing. The vast sequence information will be mapped into the reference genome of Brachypodium. This approach will realize high-effective, high-throughput and low cost flanking sequence identification of insertion mutant.

建立能够覆盖全基因组序列的T-DNA插入突变群体并鉴定出插入突变位点是功能基因组学研究的重要手段之一。传统的插入突变位点鉴定是一项非常庞大的工作。随着高通量测序技术的迅猛发展，能够利用高通量测序鉴定T-DNA插入位点将是一次重大的技术突破。高通量测序的关键是目标序列的富集及样品前处理。为此，我们以短柄草插入突变群体为材料，率先开展如何将T-DNA插入突变位点的鉴定与高通量测序技术相结合的研究。通过构建突变株系DNA三维立体池，设计与高通量测序平台兼容的、长度不对称的接头序列及一系列特异引物，以池DNA为模板进行巢式PCR扩增，特异地富集T-DNA旁侧序列进行高通量测序；对获得的大量序列信息以短柄草基因组序列作为参考序列，进行分析、拼接、比对，确定插入突变位点，达到插入突变群体插入位点旁侧序列鉴定与高通量测序平台整合的目的，实现高通量、高效率、低成本鉴定旁侧序列。

建立能够覆盖全基因组序列的T-DNA插入突变群体并进行突变位点鉴定是功能基因组学研究的重要手段。短柄草作为新型的禾草类模式植物，构建其插入突变群体对基因组庞大的麦类作物研究具有十分重要意义。然而，传统的插入突变位点鉴定方法工作量大，成本高，效率低。随着高通量测序技术的发展，本项目起初拟利用高通量测序鉴定T-DNA插入位点，但在项目实施过程中发现高通量测序长度短，T-DNA在基因组整合复杂，大多数情况测不到基因组序列。为了达到高通量鉴定T-DNA插入位点的目的，我们以反向PCR为切入点，利用其扩增片段长，鉴定比例高的优点，对其效率低，成本高的缺点进行深入研究改进。在酶切位点、引物设计最优的前提下，首先从酶切反应体系及试剂用量方面进行优化，使传统的20μl酶切反应体系缩小到2μl；随后对连接反应体系及连接酶的用量进行了优化；最后对PCR反应进行优化。在一系列实验过程中，通过选择缓冲液，将多个反应压缩在一个反应体系中完成，极大的便于自动化操作，一次可以鉴定96个株系，最终达到了高通量、低成本鉴定T-DNA插入位点的目的，而且操作简便，数据分析相对简单。与此同时，为了批量处理测序数据，快速准确找到插入位点，编写了相应的序列分析软件Perl脚本。在技术研究同时，一共分离了1300多个株系的旁侧序列，其中794个株系扩增出目的片段并进行了测序和插入位点的详细分析。该技术不仅用于短柄草T-DNA插入位点鉴定，也可以推广应用到对其它植物插入突变位点的鉴定。