白桦黄叶突变基因的克隆及功能研究

Color of leaves is a typical character of plants that associate with the development of chloroplast. It plays important roles in metabolism, differentiation and development of chloroplast of higher plants. Leaf color has many potential applications in landscapes. We obtained a birch etiolation mutant in our prior study. In this project we will locate and clone genes controlling etiolation of birch using TAIL-PCR. We will overexpress and suppress these genes in birch using agrobacterium mediated transformation, and analyze leaf color and chloroplast content of transgenic birch. In this project, we will identify identify the interacting protein and transcription factors of these genes using yeast two-hybrid and one-hybrid. Finally, we will analyze the function and mechanism of the etiolation genes in chloroplast metabolism. The results of this project will improve the photosynthetic performance of birch, provide guidance on creation of tree species, and provide gene resources for genetic engineering of colored-leaf.

叶色突变是一类具有明显表型特点且与叶绿体发育相关的突变体类型，它不仅在高等植物叶绿素的生物代谢、叶绿体分化与发育过程等相关基因功能研究具有重要意义，尤其在彩叶园林树种育种实践中具有潜在的应用价值。本项目以外源基因插入突变体-黄叶桦为试材，采用TAIL-PCR技术分离插入位点的侧翼序列，定位与克隆突变基因，构建该基因的组成型表达载体及RNA干涉载体，利用农杆菌介导法开展黄叶突变株及野生型白桦的遗传转化，进而分析转基因株系的叶色及叶绿素含量等性状，明确突变基因的功能。采用酵母单杂交系统，鉴定与该基因启动子顺式作用元件相结合的转录调控因子。采用酵母双杂交系统，筛选与该基因产物互作的蛋白，探讨该基因在叶绿素代谢途径中的调控机制，研究结果为提高白桦光合性能创造生产上有价值的林木新品种提供指导，也为园林绿化创造彩叶树基因工程新品种提供基因资源。

以T-DNA插入黄叶突变株（yl株系）为试材，采用TAIL-PCR、NGS和PacBio基因组重测序的方法对yl基因组T-DNA整合位点进行分析。在yl株系基因组中共有6个T-DNA插入位点，由于T-DNA的整合引起yl株系的3条染色体片段Chr2-3、Chr8-1和Chr8-3发生易位，3条染色体片段Chr2-2，Chr2-5和Chr9-1丢失，最终导致Chr2上的40 kb序列为纯合缺失，而纯合缺失区域包含一条BpGLK1基因。初步确定yl株系黄叶性状是由于BpGLK1的缺失所致。.PCR和RT-PCR结果显示，yl株系在DNA水平和mRNA转录水平均不能检测到BpGLK1基因。BpGLK1的功能互补实验显示，将BpGLK1基因通过农杆菌介导法转入yl株系，其叶色均得到恢复，叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的含量及叶绿素a/b值均恢复到野生型水平。.采用农杆菌介导法进行白桦BpGLK1的遗传转化，获得的BpGLK1过表达株系表现为叶片绿色加深，叶绿素含量略高于野生型。叶绿体中淀粉粒与野生型相比较大、较多；抑制表达株系与yl表型相似，叶色黄化，叶绿素含量减少，叶绿体的基粒片层和基质片层变薄，并且淀粉粒变少、变小。.BpGLK1过表达及抑制表达株系的转录组及蛋白质测序显示，抑制表达株系中与光合-天线蛋白相关基因的表达量发生了显著的变化；其差异表达蛋白主要富集在碳水化合物代谢进程中。ChIP-PCR证明，BpGLK1蛋白可能调控的靶基因是：8个天线蛋白相关基因、5个光系统亚基相关基因和4个叶绿素合成相关基因。.项目研究结果为GLK1基因在木本植物中的应用提供了依据，使得人们按照园林绿化的目标需求通过分子设计育种技术创制黄叶性状树木成为可能，同时获得的白桦BpGLK1抑制表达株系可为园林绿化提供黄色彩叶树木资源。