基于E2F1介导肝细胞增殖与凋亡途径研究截断逆挽方防治慢加急性肝衰竭的作用机制

Acute-on-chronic liver failure is a severe and complicated disease that threatens human health. But its pathogenesis is not clear and modern western medicine lacks effective treatment. Former study paid more attention to hepatic cellular apoptosis induced by agents like Fas or TNF¬-α, than abnormal proliferation of liver cells, which is closely relevant as well, yet no related reports had been retrieved. Heprescription of truncation and inverse draft had achieved significant efficacy in clinic. Experiments had also certified that this prescription could ameliorate ACLF model rats and decrease mortality by implicating the extracellular apoptotic pathway. E2F is an imperative transcriptional factor modulating cell proliferation and apoptosis. In this study, we continued to use ACLF model rats, and introduced external experiment. With advanced techno ledges like cellular, molecular, genetic chips, and flow cytometer, we probed E2F1, DP1, p53, Apaf1, TRAF2 and other key proteins associated with cellular proliferation and apoptosis. Both prophylactic and therapeutic aspects were illustrated from integral, cellular, and molecular levels, to explore how this prescription affects hepatic cellular proliferative and apoptotic pathway, and to clarify the mechanisms of Heprescription of truncation and inverse draft on preventing and treating ACLF from a brand new perspective as synergetic effect of proliferation and apoptosis. This would provide experimental evidences for application of capital tradition medical masters’ effective prescription.

慢加急性肝衰竭（ACLF），是严重危害人类健康的急重疑难病，其发病机制尚不完全清楚，西医亦无特效治疗方法。既往对本病的研究多关注Ｆａｓ、ＴＮＦ-ａ等介导的肝细胞过度凋亡，而肝衰竭的发生与肝细胞增殖障碍也有密切关系，却未见相关研究报道；前期截断逆挽方临床治疗ACLF取得很好疗效，实验研究也证实该方能通过对细胞外凋亡途径的影响，减轻ACLF模型大鼠肝细胞凋亡，降低模型大鼠的死亡率,E2F1又是能调控细胞增殖与凋亡的重要转录因子，本研究将继续采用ACLF大鼠模型，并引入离体实验，运用细胞、分子、流式细胞仪等先进技术，检测E2F1、DP1、P53、Apaf1、TRAF2等细胞增殖与凋亡关键蛋白，从预防和治疗两个方面，在整体、细胞和分子三个层面，考察截断逆挽方对E2F1介导肝细胞增殖与凋亡途径的调控作用，从细胞增殖与凋亡协同作用的全新视角进一步揭示截断逆挽方防治ACLF的分子机制。

慢加急性肝衰竭（ACLF）是临床重大疑难疾病，本课题结合全国名中医钱英教授的经验，运用免疫诱导型ACLF大鼠模型，从预防和治疗两个方面，在整体、细胞和分子三个层面，研究截断逆挽方对E2F1介导肝细胞增殖与凋亡途径的调控作用。.整体动物实验研究结果提示：（1）该方预防和治疗可以提高ACLF大鼠的存活率，降低血清ALT、AST、TBIL含量，保护肝功能，减轻肝组织病理损伤，保护肝细胞超微结构。（2）该方预防和治疗，可促进E2F1和DP1的表达，也可以促进Cyclin D1、D2 、D3 、CDK4/6和DP1、CDK4/6-Cyclin D复合物、Cyclin E-CDK2复合物的表达；对肝细胞进入S期的必需蛋白周期素A、E和Cdc25的表达也有促进作用，能正向调节E2F1介导的肝细胞增殖，其中预防干预在12h作用明显，治疗干预后在10d、15d作用明显，与模型组比较大多差异显著。（3）E2F1主要通过p53依赖性、非p53依赖性和阻断抗凋亡途径诱导肝细胞过度凋亡，该方预防和治疗，能有效降低促凋亡蛋白E2F1、Caspase3、6、7、8、9及促凋亡基因TNFR1、P53、APAF1、P73、P14ARFmRNA表达水平,促进抗凋亡基因Bcl-2、Mc1-1、TRAF2mRNA表达, 降低肝细胞凋亡率及凋亡指数，抑制肝细胞凋亡，预防干预在8小h、12h作用明显，治疗干预在第15D作用最明显,与模型组比较大多数差异有统计学意义。.细胞实验运用D-GalN诱导建立L02损伤模型，观察截断逆挽方对E2F1介导肝细胞增殖和凋亡途径的影响，结果提示，①截断逆挽方含药血清能增强LO2细胞活力，明显增加G1期、S期和G2/M期细胞比例，上调E 2F1、DP1、cyclinE、cyclinA、CDK2、cdc25AmRNA的表达量，与模型组相比表达差异有统计学意义，说明该方含药血清可以正向调节L02增殖。②截断逆挽方含药血清可以有效降低L02细胞凋亡率、有效抑制L02细胞p53、P73、Apaf1、E2F1、Caspase3、Caspase6、Caspase7、p14ARF蛋白表达水平，与模型组相比表达差异有统计学意义，说明该方含药血清可以负向抑制L02细胞的凋亡。.本研究从促进细胞增殖与抑制细胞凋亡的协同作用，阐明了为截断逆挽方防治的ACLF的作用机制，为该方的推广应用提供了实验依据