解毒凉血方上调凝集素阻抑肝细胞凋亡治疗急性肝衰竭的机制研究

Clusterin plays an important role in the inhibition of apoptosis in a variety of tumors, but its role of anti apoptosis in liver failure mechanism is still unclear. Our previous research found significant correlation between clusterin and prognosis of patients with acute on chronic liver failure. The illness is more serious, the expression of clusterin lower. The clusterin can be used to forecast the prognosis of patients with liver failure. We assumed that “Jiedu Liangxue prescription may inhibit apoptosis by up regulation of clusterin during the treatment of acute liver failure". We will be using in vitro assays and molecular biological methods to study this hypothesis, discussing the pathway of anti-apoptosis in liver failure, clarifying the anti-apoptosis mechanism of Jiedu Liangxue Decoction. It can provide treatment strategies and new targets for the acute and subacute liver failure by Chinese medicine.

肝细胞凋亡在急性肝损伤及肝衰竭形成过程中起着重要作用。凝集素（clusterin）在多种肿瘤疾病中具有抑制细胞凋亡的关键作用，但在肝衰竭中其发挥抗凋亡的作用机制尚不清楚。我们前期工作发现，凝集素与慢加急性肝衰竭患者的病情显著相关，病情越重，凝集素表达越低，clusterin可以作为判断肝衰竭预后的指标；解毒凉血方可显著提高慢加急性肝衰竭患者的生存率，并且显著上调凝集素的表达。据此我们提出假说“解毒凉血方可能通过上调凝集素阻抑肝细胞凋亡治疗急性肝衰竭”。我们将采用D氨基半乳糖联合LPS诱导的急性肝衰竭模型模拟肝炎病毒介导的急性肝衰竭过程，利用体外实验及分子生物学方法对这一假说进行验证，探讨凝集素阻抑肝细胞凋亡的途径和机制，阐明解毒凉血方发挥抗肝细胞凋亡的作用机制和靶点，为中医药治疗急性、亚急性肝衰竭提供新的治疗策略和思路。

肝细胞凋亡是急性肝损伤及肝衰竭形成过程的病理机制之一。Clusterin具有在应激状态下保护细胞阻抑凋亡的作用，我们前期的研究证实其与慢加急性肝衰竭患者的病情程度显著相关，Clusterin表达水平越低患者病死率越高。解毒凉血方是多年来我们诊治肝衰竭形成的经验处方，在临床应用及研究中已证实其疗效。本课题采用体内及体外实验对该方的疗效及作用机制开展了全面评价。首先采用体外实验通过对肝组织病理观察及凋亡细胞检测验证了解毒凉血方对D氨基半乳糖联合LPS诱导的急性肝衰竭模型小鼠肝组织具有保护作用，通过检测凋亡抑制因子Clusterin在不同组间的表达，证明了解毒凉血方具有上调Clusterin的作用，因此推测解毒凉血方发挥疗效可能是通过调节Clusterin表达发挥阻抑肝细胞凋亡的作用。在体外试验中发现解毒凉血方能有效降低TNF-α/ActD诱导的肝胞凋亡，并进一步阐明了解毒凉血方发挥疗效的作用靶点。结果显示：（1）解毒凉血方能降低急性肝衰竭模型小鼠的血浆转氨酶及总胆红素的水平（组间比较ALT：P=0.001；ASTP=0.025；TBIL P=0.000），减轻肝组织的病理损伤及减少肝细胞凋亡（TUNEL 阳性凋亡细胞百分比为解毒凉血方组vs.模型组：38.40% vs.9.70%，P = 0.002）；（2）western blot及Elisa实验证实解毒凉血方组clusterin肝组织及血浆中的表达水平较模型组显著上调；（3）体外实验证实，解毒凉血方含药血清能抑制TNF-α/ActD诱导的Chang liver细胞凋亡，将解毒凉血方含药血清设置为不同的浓度梯度5%、10%、20%三个组分别预刺激Chang Liver细胞24小时，TNF-α/ActD诱导细胞凋亡，MTT实验结果显示20%含药血清组细胞活性最高；（4）在线粒体凋亡通路中，解毒凉血方含药血清抑制caspase8和caspase3的剪切；（5）解毒凉血方含药血清能促进NF-κB 通路中IKBa及P65磷酸化进而活化NF-κB通路发挥抗凋亡作用。本研究证实了解毒凉血方治疗急性肝衰竭的有效性，并阐明了其抗肝细胞凋亡的作用机制和靶点，为中医药治疗急性、亚急性肝衰竭提供新的治疗策略和思路。