针刺对失眠模型大鼠脑组织蛋白差异表达的研究

本课题组经过总结古今文献，并采用实验方法对治疗失眠的穴位进行特异性分析后，提出由"百会"、"四神聪"、"神门"、"内关"、"申脉"、" 照海"组成的调卫健脑针法治疗失眠，经多中心临床验证疗效显著。针灸效应是通过刺激腧穴机体产生一系列生命活动的结果，与机体整体性密切相关，从静态研究难以全面反映针灸的整体疗效，而蛋白质组学技术提供了高效、动态研究的平台。将大鼠分为空白对照组、正常捆绑对照组、正常针刺治疗组、模型对照组和模型针刺治疗组，造模方法采用腹腔注射对氯苯丙氨酸混悬液，针刺治疗选取"百会"、"四神聪"、"内关"、"神门"、"申脉"、"照海"。实验结束后，取脑组织运用双向凝胶电泳技术，建立稳定性、重复性好的失眠大鼠脑组织蛋白质的双向凝胶电泳图谱。并运用生物质谱技术和生物信息学方法，寻找和鉴定与针刺治疗失眠相关的差异蛋白。通过实验，初步揭示针刺治疗失眠在针刺效应过程中的作用途径。

失眠，是以经常不能获得正常睡眠为特征的一类病证，针灸治疗失眠优势独特，但是治疗机制及针刺治疗失眠的物质基础尚未明确。针灸效应是针灸刺激通过腧穴作用于机体产生的一系列生命活动过程的表现结果，其效应过程可以通过不同的组织蛋白成分变化予以监测。与蛋白质相关的许多数据都可以通过蛋白质组学研究技术获得，机体的不同状态在蛋白质的种类和表达量上都有改变，因此针灸学研究的方向应当突破以往静态的以单个蛋白质的研究为主的方向，改变为从整体变化、动态、网络的水平上高通量的进行蛋白研究。进而从蛋白水平上对失眠及其针刺治疗机理加以探讨，试图从蛋白质水平研究失眠机理与针灸的相关性，为失眠机理研究开辟出一条新的研究途径，为临床失眠的针灸治疗提供理论依据。. 本研究采用PCPA法建立大鼠失眠模型，通过提取清洁级SD大鼠脑组织，采用双向凝胶电泳技术首次成功建立了失眠模型大鼠脑组织的2-DE图谱，使用串联飞行时间质谱法鉴定了针刺治疗失眠相关的差异蛋白。优化实验方法，利用Q-Exactive 质谱仪对各组大鼠脑组织进行 iTRAQ 分析，差异蛋白的数量得到了大幅度提高。 .本课题的研究结果显示：空白对照组与模型对照组之间测得 163个差异蛋白点，其中73个点明显表达上调，86个点明显表达下调，其中差异明显的蛋白点有浆膜蛋白4、轴突膜蛋白、波形蛋白等，提示模型制作的成功，所检测到的蛋白质有可能与失眠疾病的产生有着紧密的联系，但不一定确定属于失眠疾病的特异标志物，可能因对D组大鼠进行抓取实验时引起的反应；空白对照组与模型针刺组之间测得203个差异蛋白点，其中137个点明显表达上调，64个点明显表达下调，其中差异明显的蛋白点有微管相关蛋白2激酶、LRP-1蛋白等；模型对照组与模型针刺组之间测得118个差异蛋白点，其中82个点明显表达上调，35个点明显表达下调，其中差异明显的蛋白点有Sirtuin（去乙酰化酶沉默信息调节因子）、Sept4蛋白等。. 本实验结果说明，失眠的产生是多个蛋白共同作用的结果，同时针刺治疗失眠的相关蛋白数量较多，种类较多，说明针灸治疗失眠疗效的产生与多系统相关，蛋白的信息提示针刺治疗失眠可能与5-羟色胺突触通路、多巴胺能突触通路、蛋白激酶信号转导通路等信号转导通路有密切的关系，为明确针刺治疗失眠提供了一定依据。