Shh诱导iPSCs在慢性高眼压小鼠视网膜归巢分化为功能性RGCs的实验研究

青光眼是第一位不可逆致盲眼病, 临床上尚无有效逆转甚至控制病情的手段。诱导多能干细胞(iPSCs)替代治疗可望为这类疾病提供有效的解决方案。如何诱导iPSCs在视网膜内定向迁移并分化为功能性视网膜神经节细胞（RGC），成为限制iPSCs替代治疗在青光眼视神经病变中应用的瓶颈。我们在前期工作中发现①Shh可诱导体外培养的iPSCs分化为RGCs；②慢性高眼压视网膜中Shh表达显著提高。为此，本课题拟以Shh基因敲入和敲除小鼠为对象，研究Shh如何在活体视网膜内诱导iPSCs迁移分化为有功能的RGCs及可能的Shh/Wnt/Notch触发调控机制；进而以慢性高眼压小鼠为对象，研究iPSCs在高表达Shh的高眼压视网膜内分化、归巢迁移、及与宿主视网膜结构和功能整合的特征。并从视功能角度评估iPSCs移植对青光眼视神经损伤的治疗效果。旨在探索建立有效的青光眼视神经损伤的iPSCs替代治疗方法。

青光眼是第一位不可逆致盲眼病, 临床上尚无有效逆转甚至控制病情的手段。诱导多能干细胞(iPSCs)替代治疗可望为这类疾病提供有效的解决方案。如何诱导iPSCs在视网膜内定向迁移并分化为功能性视网膜神经节细胞（RGC），成为限制iPSCs替代治疗在青光眼视神经病变中应用的瓶颈。本课题发现，在高水平表达Shh的视网膜内，玻璃体腔移植和视网膜下腔移植iPSC后，都可以诱导更多的iPSC移行到RGC细胞层。玻璃体腔移植方式中移行到RGC层的iPSC和分化的细胞要多于视网膜下注射者，分化和移行的数量跟iPSC在体外培养的时间（1、14、21和28天）无明显关系。另外，在免疫荧光双标中发现，分化的细胞中出现Pax6、Map2阳性，说明Shh可诱导iPSC向神经元方向分化。研究结果表明Shh高表达的微环境可以促进iPSC定向归巢分化的过程Shh诱导iPSC 归巢分化为RGC具有一定的可能性。结论：1、Shh可以诱导iPSC 向RGC层迁移。2、迁移的部分细胞可见表达神经元标记。本课题结果为Shh诱导iPSC定向分化为RGC提供了实验数据。提示若能深入研究调控Shh的表达量和表达时间诱导iPSC在视网膜内定向归巢分化为RGC，有望探寻出一种稳定诱导RGC的方法。所有数据正在整理成文。此外，我们在此基础上新增部分研究内容，即采用knock-in的方法构建了可以直接观察到iPSC是否分化为RGCs的表达调控载体Brn3a knock-in vector，可望为后续研究及其他相关课题研究提供了更有力的iPSC细胞平台。