Dax1新剪切体调控胚胎干细胞自我更新和分化的作用及机制研究

Embryonic stem cells (ESCs) can maintain self-renewal and pluripotency, but the mechanisms are not well understood. Dax1 is a key factor in regulating of self-renewal and pluripotency in ESCs , which acts as a transcription repressor and prevents differentiation of ESCs into extra-embryonic endoderm. Recently, we identified a alternative new spliced variants of Dax1 (Dax1S).Primary data showed that Dax1S and Dax1 function differently;Moreover,Dax1S can represse expression of Cdx2，which functions as the trophoectoderm (TE) specifier. These results indicate that Dax1S may inhibit the differentiation of ESCs into TE. In this project, we plan to first explore the role of Dax1S in ESCs self-renewal and differentiation by molecular-cellular and functional assessment; Then to confirm the inhibition of Dax1S on Cdx2 expression and TE differentiation by molecular methods for transcriptional regulation and TE differentiation assay; Finally to analyze the transcriptional regulatory network of Dax1S with microarray and Chip-Seq. We hope to uncover the biological role and mechanism of Dax1 in ESC fate determination through these studies. These studies will provide new insight into Dax1S functions, offer new clues to understand the molecular mechanisms underlying lineage commitment in ESCs, and also provide references for the study of Dax1 function in other research area, such as cancer.

胚胎干细胞（ESC）能自我更新并保持多向分化潜能，但其调控机制还不十分清楚。Dax1是维持ESC自我更新和多能性稳态的关键分子，能阻止ESC向原始内胚层分化。我们近期发现了Dax1的一个新剪切体（Dax1S）。初步研究显示，Dax1S与Dax1在功能上不同，且能抑制滋养外胚层（TE）决定基因Cdx2的表达，提示Dax1S具有抑制ESC向TE分化的功能。本项目拟结合细胞功能实验和分子水平检测，明确Dax1S在ESC自我更新和分化中的作用；通过转录调控相关的分子生物学方法和TE分化实验证实Dax1S对Cdx2表达和TE分化的抑制功能；通过表达谱芯片和Chip-Seq分析Dax1S的转录调控网络，以此阐明Dax1S调控ESC命运的分子机制。本研究是对Dax1基因功能的全新注释，并丰富对ESC命运决定机制的认识，还将为Dax1在其他领域（如肿瘤）的研究提供参考。

可变剪切是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机制，对胚胎干细胞自我更新和多能性维持起着关键的调控作用。Dax1是维持胚胎干细胞自我更新和多能性稳态的关键转录因子，但其可变剪切体及相关功能尚不清楚。本项目利用cDNA末端快速扩增技术 (RACE) 对胚胎干细胞中的Dax1剪接体进行分析，通过构建Dax1敲除、挽救、过表达的细胞模型和克隆形成、增殖、分化、RNA-seq等实验方法分析新发现剪切体在调控胚胎干细胞自我更新及分化中的作用，通过萤光素酶报告实验和ChIP-qPCR验证Dax1新剪切体对Gata6的转录调控作用，并通过构建Dax1靶基因Abhd11可诱导表达的细胞模型，分析Abhd11过表达、敲除对胚胎干细胞自我更新和分化的影响。研究发现，Dax1基因可产生17种选择性剪切体，这些剪切体广泛存在于多种组织中，且在胚胎干细胞中呈现异质性表达，其亚细胞定位也存在差异。敲除Dax1导致胚胎干细胞呈现严重的分化和凋亡表型。Dax1剪切体中，仅Dax1-404与Dax1-472能挽救Dax1敲除胚胎干细胞的缺陷表型。然而，Dax1-472和Dax1-404过表达抑制胚胎干细胞自我更新和分化。ChIP-qPCR分析发现Dax1-472、Dax1-404 、Dax1-38可以与Gata6启动子DNA片段特异性结合。Dax1-472和 Dax1-404均能抑制Gata6的转录活性。并且Dax1-38可竞争性拮抗Dax1-472对Gata6转录活性的抑制。此外，敲除Dax1的靶基因Abhd11，抑制胚胎干细胞自我更新和分化。本研究通过分析胚胎干细胞中Dax1的剪切体及其功能，增加了对Dax1基因功能的全新认识，具有创新性和重要意义，有望为Dax1在其他研究领域（如肿瘤）的研究提供借鉴思路和线索。