板层状鱼鳞病TGM1突变基因的功能研究

转谷氨酰胺酶 1（TGM1）基因突变是板层状鱼鳞病（LI）的主要致病基因。本课题拟构建真核细胞TGM1基因RNAi慢病毒载体，转染HaCaT细胞，特异性诱导TGM1基因mRNA降解，建立TGM1基因敲除的HaCaT细胞模型；构建TGM1突变基因慢病毒载体，将其转入TGM1基因敲除的HaCaT细胞中，建立表达TGM1突变基因的HaCaT细胞模型。在此基础上观察TGM1基因敲除与TGM1基因突变对角质形成细胞形态、生物学特性的影响，检测RAF-1、黏着斑激、周期素D1等蛋白的表达差异，探讨TGM1基因突变影响细胞周期的机制；观察TGM1基因突变对细胞超微结构的影响，及对角蛋白10、内披蛋白、兜甲蛋白及SPRP等角质包膜相关蛋白表达的影响，探讨LI的基因型与皮肤超微结构及临床表型之间的关系。预期研究结果为探索体外研究鱼鳞病发病机制建立了有效途径，并对其他遗传性皮肤病发病机制研究提供借鉴作用。

转谷氨酰胺酶 1（TGM1）基因突变是板层状鱼鳞病（LI）的主要致病基因。本课题成功构建并筛选出最有效抑制TGM1表达的shRNA序列-1649shRNA，结果显示显著抑制了TGM1的表达，抑制率达91％。成功构建了TGM1基因敲除的HaCaT细胞模型，和表达TGM1基因R142C突变体、S212F突变体、R143C突变体及R143C和S212F复合突变体的HaCaT细胞模型。在此基础上通过采用绘制细胞生长曲线、流式细胞仪检测等方法研究发现，R143C突变可明显抑制角质形成细胞的增殖率，并诱导角质形成细胞的细胞周期停留在S期，不能完成DNA的合成，无法进入M期，未完成细胞的分裂。认为TGM1基因R143C突变与角质形成细胞的细胞周期及细胞凋亡密切相关。并通过免疫组化及Westernblot检测发现，TGM1基因R143C突变后细胞周期相关蛋白cyclin D1、cyclin B1、CDK4表达明显抑制。研究结果进一步提示TGM1基因R143C突变是通过抑制cyclin D1、cyclin B1、CDK4表达，而影响角质形成细胞的细胞周期。通过免疫组化及Westernblot检测发现，TGM1基因R143C突变后影响角质包膜形成相关蛋白中的内披蛋白、兜甲蛋白及SPRP的表达明显抑制。研究结果提示TGM1基因R143C突变通过抑制表皮角质形成细胞内披蛋白、兜甲蛋白及SPRP的表达影响角质包膜的形成。