小发夹RNA对板层状鱼鳞病TGM1突变基因表达的调控研究

Ichthyosis. Studies indecated that RNA interference technology based on short hairpin RNA(shRNA) has a very strong ability to make the target gene keeping silence for a long time and decreaseing the gene mutation. In this project we designed a virus expression carrier, witch can interfere with TGM 1gene mutation. We can get the mouse model with TGM1 mutant gene after injection the virus expression carriers into the mouse's epidermal cells. Based on the above studies, we then designed a fluorenscence labeled probe which can hybridised with TGM 1 mRNA in epidermal cells of TGM1 mutant gene mouse model. Through this method we can clearly observed the expresstion of TGM1 mutant gene in alive mouse model, and we can estimate the shRNA intere effect at anytime only by read fluorenscence signal. Further more, we designed a enzyme sensitivity and excitated probe to detect the activity fo TGM1 in alive mouse model, advanced to investigate the regulation funtion of shRNA interference. The results may show a promise, potencial and very useful approach of gene therapy in lamellar Ichthyosis, and provide a basic knowledge for treatment other inherited skin disorders.

转谷氨酰胺酶 1（TGM1）基因突变是板层状鱼鳞病（LI）的主要致病基因。研究表明小发夹RNA（shRNA）介导的RNAi能高特异性持久地沉默特定基因，降低突变。本课题拟构建针对TGM1突变基因的shRNA慢病毒载体，转入裸鼠表皮内后建立表达TGM1突变基因的动物模型。在此基础上设计荧光标记探针，注入裸鼠表皮内后与TGM1基因进行体内荧光杂交。通过探测裸鼠活体细胞内荧光信号强度来判断TGM1突变基因mRNA的表达情况；并用酶敏感可激发探针检测裸鼠体内微量的TGM1活性，探讨shRNA对TGM1突变基因mRNA表达的调控作用，期望使突变的等位基因恢复互补状态、功能性多肽表达并发挥疗效，表皮屏障功能得以重建。本研究首次提出用shRNA介导的RNAi 高特异性地沉默板层状鱼鳞病TGM1 突变基因，研究结果将为鱼鳞病的基因治疗建立经济有效的途径，并对其他遗传性皮肤病的基因治疗提供科学的理论基础。

板层状鱼鳞病（lamellar ichthyosis，LI）是一种以皮肤广泛鳞屑和角化过度为特征的常染色体隐性遗传性皮肤病，其发病率约为 1/30万。多数患者幼年发病，需终身治疗；部分患儿发生死胎或于产后早期死亡，给患者及其家庭成员造成极大的精神痛苦和经济压力。本课题首先对10个板层状鱼鳞病家系进行突变基因检测，发现了6例错义突变 (R142C, R143C, S212F, E242G, G382R, T529I); 2个无突变义 (Q202X, R348X); 4例剪接位点突变 (Intron10 A>G, Intron12 T->G, Intron13 G->A); 2例5′调控区突变，1例 3′调控区突变和1个缺失突变。在此研究基础上构建了TGM1突变基因转染的细胞表达载体，从全基因组水平进行了差异性基因表达分析并做了KEGG信号通路富集分析，构建了基因互作网络。进一步用Western blot检测了相关信号通路中关键蛋白的表达情况，并用免疫组化检测了板层状鱼鳞病患者皮损中10个重要的表皮角蛋白和结构蛋白的表达水平，深入探讨了TGM1突变基因对维持表皮正常结构和功能的基因表达的影响。. 差异性基因表达分析研究结果表明板层状鱼鳞病TGM1 突变基因导致了大量表皮结构蛋白和连接蛋白等维持皮肤结构完整和正常功能的基因表达异常。免疫组化结果显示板层状鱼鳞病患者皮损中TGM1、TGM3、 EGFR的表达明显下降；表皮结构蛋白和连接蛋白角蛋白10、DSP、DSG1、FLG、LOR、IVL等也是明显下降，角蛋白14表达增强。KEGG信号通路富集分析结果发现TGM1可能通过钙调蛋白/IPs受体结合位点，激活PI3K/AKT信号通路使胞内Ca2+失衡，引发酶和激素分泌、细胞周期调控和细胞凋亡异常，导致角质细胞过度增殖和皮肤屏障功能受损。本项目首次在全基因组水平探讨了板层状鱼鳞病TGM1 突变基因对表皮结构和功能的影响，研究结果将为进一步明确板层状鱼鳞病的发病机制和开发经济有效的治疗药物提供科学的理论依据，并为其它遗传性角化性皮肤病的治疗提供思路。.