HPV16E6/E7经Atg16L1调控宫颈癌细胞自噬及对病毒生存和致癌力的影响

High-risk human papillomavirus (HR-HPV) persistent infection is an essential for cervical cancer development. Viral early proteins, E6 and E7, are critical factors in cervical tumorigenesis, but whether or how the viruses transform host cells and thereby obtain persistent infection is poorly understood. It was reported that some viruses could maintain cellular homeostasis to optimize their survival by modulating autophagy. Our previous primary study showed that HPV16 E6/E7 induced autophagy via Atg16L1 and facilitated to maintain cellular homeostasis and E6/E7 overexpression in cervical cancer cells. In this study proposal, we plan to observe the effect of HPV16 E6/E7 on cell autophagy, as well as involved pathway, and the influence of autophagy on viral E6/E7 expression and cell malignant behavior, from the visual angle of the interaction between viral early protein and host cell autophagy and at the different levels including molecules, cells, tissues, and animal models. The aim of our study is to explore how HPVs modulate cell autophagy for their survival and carcinogenetic ability.

高危人乳头瘤病毒（HR-HPV）持续感染是宫颈癌发病的必需因素。已知HR-HPV早期蛋白（E6、E7等）是关键的致癌蛋白，但对其能否和如何改造宿主细胞以获得持续感染知之甚少。研究表明病毒可通过调控自噬来维持细胞稳态而获得自身长期存活。我们初步研究发现，HPV16 E6/E7可能通过Atg16L1促进宫颈癌自噬，以维持细胞稳态和E6/E7高表达。本项目从病毒早期蛋白与宿主细胞自噬相互调控为切入点，拟从分子、细胞、组织及动物模型多个水平，先通过调控HPV16 E6/E7表达，观察早期蛋白对细胞自噬的影响；再利用RNA-seq、免疫共沉淀等技术筛选并确定Atg16L1为参与调控的分子；最后采用CRISP技术反向调控细胞自噬，观察对HPV16 E6/E7表达及细胞恶性表型的影响，从而诠释HR-HPV早期蛋白如何调控宿主细胞自噬，进而维持病毒毒自身生存并促进致癌能力。

中晚期宫颈癌致死率高，现有治疗手段疗效有限，仍是全球女性健康的一大威胁。宫颈癌是由DNA 致瘤病毒所致，HR-HPV 持续感染而形成的实体性肿瘤。近年来，自噬在肿瘤和感染性疾病中的作用越来越受到重视，调控自噬有望作为一种新的治疗手段应用于临床。但关于HPV 癌蛋白如何调控自噬及自噬在宫颈癌发生发展中的作用，目前研究甚少。本研究中，我们首先确定了在宫颈癌细胞中HPV 16E6/E7 表达下调可抑制自噬，并可能是在自噬的起始阶段进行调控。在HEK293 细胞中过表达16E6 或16E7 后，自噬体合成增加且降解加快。用药物或RNAi 技术破坏自噬后细胞增殖减少、早期凋亡数目增加，细胞活力受限。而用自噬诱导剂则能抑制细胞凋亡。进一步，我们用RNA 测序及生物信息学分析的方法在586 个差异表达基因中筛选出Atg9B 和LAMP1 可能是16E6/E7 调控自噬过程中的关键分子。下调Atg9B 后LC3-II 表达降低，而干扰LAMP1 表达后LC3-II 表达累积。在16E6/E7 低表达的SiHa 和CaSki 细胞中过表达Atg9B 可使LC3-II 累积，而过表达LAMP1 则LC3-II 降解加快。后续的一系列实验证实，16E7 则与Atg9B直接结合，促进自噬体的生成然后转运至溶酶体发生融合后加速其降解，16E6 通过与启动子特定区域结合在转录水平上调Atg9B 和LAMP1 表达。我们的结果提示，HPV 16E6E7 通过Atg9B 和LAMP1 途径激活宫颈癌细胞自噬，从而维持宿主细胞活力。我们的发现为宫颈癌靶向自噬治疗提供了证据。