烟草脉斑驳病毒变异株的非编码RNA引发症状减轻的分子机制

The non-coding region of viral genome plays an important role in the induction of symptoms. One mutant of Tobacco vein mottling virus (TVMV), TVMVpXBS8, including 58 nt "AU" Rich element at 3´UTR (a special loop and stem structure appeared in the mutated viral infection clone comparing with wild type sequence) is able to infect as wild type virus, but with the attenuated symptoms in host. The DCL enzyme is the first protein to recognize the virus when the virus interacts with the host's gene silencing system. It is suggested that the specific secondary structure of 3' non-coding region RNA of TVMVpXBS8 can be recognized by the DCL protein in the host and the siRNAs are specifically produced, which might regulate the expression of development-related gene in host and resulted in the symptoms attenuation. To verify this hypothesis, we will study the relevant of mutation of the secondary structure in 3' noncoding region and DCL mutant plant to the symptom attenuation induced by TVMVpXBS8. We´ll analyze the virus-derived siRNAs mapping to the TVMVpXBS8 3´UTR and the regulation function on the symptom related gene in host. In addition, the cross protection effect of mutant virus and its 3' noncoding RNA on other Potyvirus will be examined. The results will not only reveal the molecular mechanism of symptomatic attenuation caused by the non-coding region of TVMV mutant isolate, but also apply to develop TVMVpXBS8 as useful isolate for cross protection against Potyvirus diseases in field.

病毒基因组的非编码RNA在病毒侵染的症状形成中起着重要作用，但作用机制尚不明确。前期研究发现烟草脉斑驳病毒变异株TVMVpXBS8的3'非编码RNA含58-nt¨AU¨重复序列的茎环结构，能够引发寄主症状明显减轻。DCL酶是基因沉默系统中识别并剪切病毒mRNA的蛋白。因此，推测症状减轻的机制可能是DCL酶识别该病毒特异二级结构的非编码RNA，剪切产生的siRNAs作用于寄主内源发育相关的基因。申请者拟分别研究二级结构突变体病毒和DCL酶突变体植物与症状减轻的关系，以及源于该二级结构的siRNAs对寄主内源靶基因的调控，阐述病毒非编码RNA影响寄主症状形成的分子机制。在此基础上，研究该病毒变异株和3'非编码RNA对同属其它病毒的交叉保护作用。研究结果不仅能够在理论上揭示TVMV病毒变异株的非编码RNA引起症状减轻的分子机制，而且对马铃薯病毒病防治中交叉保护株系的开发和利用也具有实际指导意义。

病毒基因组的非编码RNA在病毒侵染的症状形成中起着重要作用，但作用机制尚不明确。前期研究发现烟草脉斑驳病毒变异株TVMVpXBS8的3'非编码RNA含58nt-AU重复序列的茎环结构，能够引发寄主症状明显减轻。本项目重点研究该病毒非编码RNA影响寄主症状形成的分子机制。采用Gibson的自制克隆技术，一步构建成功TVMV病毒的侵染性克隆pLX-TVMV。通过一次性Illumina测序对pLX-TVMV质粒进行了序列验证。农杆菌介导的瞬时表达技术在本氏烟上进行侵染性试验结果表明该侵染性克隆具有侵染性，能够引起TVMV典型症状。根据pLX-TVMV的序列，成功构建了TVMVpXBS8病毒变异株的侵染性克隆。在本氏烟上进行瞬时表达结果表明，病毒变异株的侵染性克隆能够成功侵染本氏烟，侵染症状比野生型TVMV较轻，但病毒积累量与野生型病毒无明显差异。变异病毒TVMVpXBS8的侵染稳定性研究结果表明在本氏烟上第5次传代后仍然具有稳定的侵染性。采用生物学软件mfold对进行了TVMVpXBS8病毒变异株3’非编码RNA的二级结构进行了预测。根据预测的二级结构，设计了打破二级结构的突变（TVMV58mutA、TVMV58mutB）和回补二级结构突变（TVMV58mutC），研究是否二级结构决定了病毒变异株引发的症状减轻。结果发现TVMV58mutA的植株表现出畸形和脉明的典型症状，病毒积累水平与TVMV58和TVMVwt相似。TVMV58mutB侵染后植株无侵染症状，无病毒积累。说明核苷酸成分对病毒复制和TVMV58感染引起的症状减弱至关重要，与二级结构不相关。根据烟草本氏烟的DCL酶基因序列，设计合成了特异性引物，构建了TRV介导的DCL沉默载体。转化到农杆菌C58C1中进行瞬时表达，再接种TVMVpXBS8变异病毒，研究DCL酶与TVMV侵染的相关性。结果发现烟草的DCL沉默植株接种病毒后，与野生型的本氏烟表型没有明显变化，病毒积累量也无明显差异。这说明瞬时表达DCL沉默载体可能与TVMV病毒积累量无关。研究发现变异病毒TVMVpXBS8对野生毒株和其它同属病毒PVYros和TuMV-GFP具有交叉保护作用。研究结果在理论上揭示TVMV病毒变异株的非编码RNA引起症状减轻的分子机制，对交叉保护株系在病毒病防治中的应用具有实际指导意义。