甜椒脉斑驳病毒6K1蛋白调控病毒复制的分子机制研究

Capsicum chinense is well known as one local specialty chilli in Hainan, and currently it has being severely damaged by pepper veinal mottle virus (PVMV), one member in the genus Potyvirus. The +ssRNA genome of PVMV encodes two polyproteins that are proteolytically processed by three viral proteinases into 11 mature proteins, including two molecular weight of 6-kDa proteins 6K1 and 6K2. Previously, we demonstrated that either PVMV or Plum pox virus (PPV, Potyvirus) 6K1 protein formed punctuate inclusions in presence of viral infection, were associated with core components of viral replication complex (VRC), and colocalized in the periphery of chloroplasts and nuclei, in which potyviral replication was believed to occur. However, the molecular mechanism is largely unknown about how 6K1 protein is recruited to viral replication site and interact with VRC. In this study, the pathosystem of PVMV/Nicotiana benthamiana (C. chinense) is employed to address the above questions. In brief, host or viral proteins interacting with 6K1 protein will be screened and identified, and their potential roles in recruiting 6K1 protein to viral replication site and mediating 6K1/VRC interaction will be dissected. The anticipated results will provide new insights to designing novel strategies of PVMV resistance in C. chinense.

黄灯笼辣椒是颇具海南地方特色的辣椒种类，但近年来遭受甜椒脉斑驳病毒（PVMV，Potyvirus）等的危害日趋严重。PVMV基因组编码的融合蛋白在病毒蛋白酶作用下产生11种成熟蛋白，其中包含两个分子量为6kDa的蛋白—6K1和6K2。先前我们研究表明：PVMV和该属李痘病毒（PPV）的6K1蛋白在相应病毒感染细胞中形成点状内含物，与病毒复制复合体（VRC）核心组份共定位于叶绿体和细胞核的周围区域（Potyvirus病毒复制场所），是VRC的重要组份。但有关6K1蛋白如何被招募至病毒复制位点以及6K1与VRC相互作用的分子机制尚未明确。本研究我们采用PVMV/本氏烟（黄灯笼）致病系统，综合利用生物化学、分子生物学和细胞生物学等技术手段，鉴定寄主或病毒蛋白在招募6K1至病毒复制位点以及介导6K1/VRC互作中的功能作用。预期研究结果为设计新颖的黄灯笼辣椒抗PVMV策略提供新思路。

马铃薯Y病毒属（Potyvirus）是第一大植物RNA病毒属，包括多种农业和经济上重要得病毒种类。该属病毒+ssRNA基因组编码的融合蛋白在3种病毒蛋白酶（P1，HC-Pro和NIa-Pro）酶解作用下产生11或12种成熟蛋白，其中包含两个低分子量病毒蛋白-6K1和6K2。先前研究发现6K1蛋白在病毒感染细胞中形成点状内含物，与病毒复制复合体核心组份共定位，但6K1蛋白确切的生物学功能及作用机制尚不明确。本项目以甜椒脉斑驳病毒黄灯笼辣椒分离物（PVMV-HNu）为研究对象，构建了PVMV-Hnu侵染性cDNA克隆，证实此克隆可高效侵染模式寄主-本氏烟和自然寄主-黄灯笼，为深入探究6K1蛋白功能作用及分子机制提供反向遗传学分析工具。本项目分析了6K1蛋白在病毒侵染过程中的动态表达状况，发现P3-6K1接合位点可被NIa-Pro高效切割，但成熟6K1蛋白难以检测。突变P3-6K1接合位点（以使NIa-Pro无法识别/切割）导致病毒丧失侵染活性，表明成熟6K1蛋白对病毒侵染至关重要。序列分析发现Potyvirus病毒6K1蛋白存在17个保守氨基酸位点，其中15个单氨基酸突变废除了病毒侵染活性（本氏烟和黄灯笼）。为验证以上保守氨基酸位点与6K1生物学功能关联性，本研究在6K1突变的致死病毒克隆中顺式回补野生型6K1，检测结果表明：顺式回补6K1无法拯救致死病毒克隆的侵染活性，表明P3-6K1融合蛋白在病毒侵染过程中行使关键功能。反之，在野生型病毒克隆中顺式表达6K1突变体（点突变位于C端），侵染测试结果表明：顺式表达6K1突变体显著削弱病毒侵染活性。进一步研究发现细胞自噬靶标降解6K1蛋白，促进病毒复制，而6K1突变体拮抗这一降解过程。本项目首次证明单独6K1蛋白在病毒侵染过程中行使关键生物学功能，揭示6K1蛋白自噬降解正调控病毒复制和侵染的新机制。