m6A 甲基化在马铃薯Y病毒属病毒侵染中的作用及其机制

M6A RNA methylation is a post-transcriptional modification in the internal sequence of mRNA and noncoding RNA. In recent years, m6A RNA methylation has been widely concerned and is becoming a hotspot in the field of life sciences. In human RNA viruses, it is found m6A methylation in viral genome mRNA has a certain regulatory role in virus replication. However, the modification of m6A in plant viral RNA and its function in viral infection remain unknown. Our previous studies showed that the expression of m6A demethylase isozymes, ALKB5-like, are significantly up-regulated in PPV-infected N.benthamiana. While the expression of methylase-like genes, METTL21A like or homologous do not change significantly. Here, LC-MS/MS and m6A-CLIP sequencing will be usedA to map the m6A methylation sites in potato virus Y (PVY) and plum pox virus (PPV) infected tobacco(N.benthamiana). We will analyze the relevant of viral infection to ALKB5like and METTL21A like knock-down and over expression plant. The effects of PVY and PPV virus infection on the m6A methylation profile of the host endogenous gene are also included. This will clarify wheather there are m6A methylation sites in potyvirus RNA and the possible relevant of the m6A RNA methylation and plant viral infection. The results help to reveal the new mechanisms of epigenetic regulation of plant virus-host interaction, which providing a new potential target of anti-viral strategies for the protection of potato viral diseases in the application point.

m6A甲基化是生物mRNA和非编码RNA的一种转录后修饰形式，是生命科学领域的研究热点。m6A甲基化对人类RNA病毒复制具有调控作用。植物RNA病毒是否也存在m6A甲基化修饰位点及其对病毒侵染的影响？迄今未见相关报道。申请者研究发现李痘病毒(PPV)侵染烟草后，m6A去甲基化酶基因ALKB5like明显上升，甲基化酶基因METTL21Alike没有变化。本项目将利用液相色谱技术和m6ACLIP技术鉴定马铃薯Y病毒(PVY)和PPV的m6A甲基化修饰位点；克隆烟草ALKB5like和METTL21Alike基因；研究这两个基因过表达和基因沉默后与病毒侵染的关系。阐明马铃薯Y病毒属病毒RNA中是否含有m6A甲基化修饰位点及其m6A甲基化是否与病毒侵染相关。这有助于揭示植物RNA病毒与寄主互作的表观遗传学调控新机制，为马铃薯病毒病的防治策略研发提供新切入点。

m6A甲基化是生物mRNA和非编码RNA的一种转录后修饰形式，是生命科学领域的研究热点。m6A甲基化对人类RNA病毒复制具有调控作用。本项目以两种马铃薯Y病毒属病毒，马铃薯Y病毒（PVY）和李痘病毒（PPV）为对象研究了病毒侵染后对寄主内源和病毒RNA的m6A甲基化修饰的影响，及其对病毒侵染有何影响。结果发现，病毒侵染后的m6A甲基化整体水平比对照明显降低。m6Aseq测序技术进一步明确了病毒RNA基因组和寄主内源基因的m6A甲基化变化。PVY和PPV侵染后寄主内源基因的m6A甲基化水平比对照明显降低。PVY病毒RNA上有4个m6A富集区域，PPV病毒RNA上有2个m6A富集区域。根据病毒侵染本氏烟的系统叶片转录组测序中的ALKB和METTL序列，克隆已获得2个nbALKB基因、2个nbMETTL21基因和拟南芥中的1个ALKBH9基因、3个YTH基因（ECT2、ECT3、ECT4）。将扩增获得的基因克隆到了植物双元表达载体pEAQ-DEST1中。在本氏烟中，农杆菌介导的瞬时表达后摩擦接种病毒，结果发现nbALKB基因对PPV病毒侵染没有影响，nbMETTL对PPV侵染有一定的抑制作用。瞬时表达上述基因对PVY病毒侵染在症状上也没有表现出明显的表型差异， PVY病毒的积累量实验正在进行中。已分别获得了上述8个基因过表达的转基因本氏烟，转基因植株对2种病毒侵染的影响研究正在进行中。成功构建了上述8个基因的TRV-介导的基因沉默载体，目前正在进行共注射实验研究沉默基因后对病毒侵染的影响。将nbALKB克隆到PPV病毒的侵染性克隆的研究正在进行中。 . 本项目阐明了m6A甲基化修饰是否与PVY和PPV病毒侵染具有相关性的关键问题，一方面明确了病毒侵染导致寄主内源基因m6A甲基化水平改变；另一方面病毒RNA也能够被寄主m6A甲基化系统所修饰，影响病毒复制。项目的研究结果这有助于揭示植物RNA病毒与寄主互作的表观遗传学调控新机制，为马铃薯病毒病的防治策略研发提供新切入点。. 本项目的研究结果正在撰写研究论文2篇，培养硕士研究生2名。项目资助经费25万元，已使用24.92万元，结余经费804.24元，基本上满足了项目的实施。