基于P糖蛋白核酸适配体分子探针的傣药龙血竭脑靶向转运及抗脑缺血药效物质基础研究

Specific aptamers (AptP-gp) are selected using P-glycoprotein (P-gp) as target, which is the main efflux transporter in brain-blood barrier. Study on in vitro and in vivo interaction between Dragon’s blood, AptP-gp and P-gp will be performed with microdialysis and HPLC-MS methods. The chemical constituents specifically binding AptP-gp and P-gp，the potential substrates of P-gp could be elucidated by determining combination constants between AptP-gp/P-gp and multi-components of Dragon’s blood. The AptP-gp brain targeting ability could be evaluated by changed levels of multi-components of Dragon's Blood in rat brain with addition of AptP-gp. Whether P-gp is the efflux transporter for multi-components will be determined with AptP-gp as competitive binding probe. Anti-ischemic material basis will be elucidated by precise localization and targeting delivery capacities of AptP-gp. Targeting sites of Dragon’s blood in rat brain could be analyzed by fluorescence-labeled AptP-gp. By introducing the newly emerged functional molecule-aptamer into basic research of Dai medicine, study on multi-component targeting delivery, localization and therapeutic material basis identification using aptamers prove to be significantly innovative, which could provide a new idea and approach for traditional Chinese medicine research.

以血脑屏障上主要外排蛋白P糖蛋白（P-gp）为靶标，筛选其特异性抑制剂-核酸适配体AptP-gp。结合微透析采样及液质联用技术，开展傣药龙血竭、AptP-gp、P-gp三者间体内、体外相互作用研究。依据龙血竭与P-gp、AptP-gp间结合常数，阐明与AptP-gp特异结合的化学成分群、分析AptP-gp对龙血竭多成分脑靶向运输能力。将AptP-gp作为竞争分子探针，识别哪些成分为P-gp潜在底物、确定P-gp是否为龙血竭进入鼠脑的主要外排蛋白。利用AptP-gp对血脑屏障P-gp精准定位和促龙血竭跨血脑屏障转运能力，阐明龙血竭抗脑缺血药效物质基础。利用荧光标记的AptP-gp可视化识别龙血竭鼠脑内靶点定位。本项目将新兴热点功能分子-核酸适配体引入到傣药研究中，基于其独特性能研究傣药多成分脑靶向运输、靶点定位、效应成分群识别，具有明显创新性，或为傣药基础研究提供可借鉴的新思路及新方法。

本研究以血脑屏障上主要外排蛋白P糖蛋白（P-gp）为靶标，筛选其特异性抑制剂-核酸适配体（Apt）。开展傣药龙血竭、Apt、P-gp间体内、体外相互作用研究。具体研究内容、结果、重要数据如下：. 1）建立了P-gp核酸适配体Apt的筛选方法，得到14条适配体。Apt的特定碱基序列、凸环结构域等，或是能特异性结合靶蛋白P-gp的关键结构。与P-gp的亲和性最高的是Apt6号和Apt1号。2）采用毛细管区带电泳法表征了7种龙血竭有效分子与P-gp及Apt 6之间的相互作用。发现龙血素A及B、白藜芦醇、紫檀芪、7,4´-二羟基黄酮与P-gp有显著结合，龙血素C、5,7,4´-三羟基黄酮与P-gp没有结合作用。Apt6与龙血素B及C、紫檀芪、5,7,4´-三羟基黄酮有显著结合，龙血素A、白藜芦醇分子与Apt6未表现出明显结合。结合作用大小或与化合物苯环上取代基位置、种类、数量等因素有关。3）体内外实验证明Apt6具有抑制P-gp外排功能的作用。4）大鼠口服给与龙血竭后，采用超高效液相色谱串联高分辨质谱法，鉴定到鼠脑中5个原型分子和代谢物，给予高剂量Apt6后，未检测到该5个化合物的含量有显著变化。大鼠血液中鉴定到约20个化合物，完成了龙血竭中6个主要化合物的药物动力学研究。5）CY5标记的Apt6可以对鼠脑微管内皮细胞上P-gp进行定位，显示了P-gp在鼠脑内的分布。. 本项目首次筛选得到了P-gp的核酸适配体，其与靶蛋白结合具有高亲和力与特异性，有望成为中药药效物质基础研究及靶向转运中的分子工具。P-gp核酸适配体或为促进药物在肠道、脑内的吸收、抑制肿瘤多药耐药等研究，提供一个新型、高效的外排功能抑制剂。荧光标记的Apt也可以成为与P-gp体内成像相关研究的潜在分子探针。