基于与核酸适配体相互作用研究龙血竭抗凝血靶点及物质基础

Based on the target binding and delivery functions of aptamer, the newly emerging recognition molecule, study on in vitro and in vivo interaction between Dragon's blood, thrombin inhibitor aptamers Apt 15 and Apt 29 and thrombin will be performed with microdialysis and HPLC-MS method. The chemical constituents with thrombin inhibitory effect will be elucidated by binding constants between thrombin and multi-components of Dragon's blood. Whether multi-components could bind heparin and fibrinogen exosites will be determined with Apt 15 and Apt 29 as competitive binding probes. The chemical constituents in Dragon's blood which could specifically bind with Apt 15 and Apt 29 will be elucidated. Effect on level of multi-components of Dragon's Blood in rat brain will be studied with the addition of Apt 15 and Apt 29. Target delivery to rat brain and synergism between aptamers and Dragon's blood will be observed with the pharmacological results. By cross-use of TCM theory and modern molecular biology techniques, study on multi-component target positioning ,selevtive delivery and material basis identification based on aptamers will provide a new idea and approach for TCM research with a significant innovation.

基于目前热点识别分子-核酸适配体的靶点定位及选择性运输功能，结合微透析采样及液质联用技术，首次开展龙血竭与人凝血酶抑制剂核酸适配体Apt 15、Apt 29及凝血酶间体内外相互作用研究。测定龙血竭多成分与凝血酶、Apt 15、Apt 29间结合常数，确定抑制凝血酶的化学成分群、与Apt 15、Apt 29特异结合的化学成分群。将Apt 15、Apt 29作为凝血酶位点竞争结合探针，确定龙血竭多成分是否作用于凝血酶肝素或纤维蛋白原结合位点。观察Apt 15、Apt 29对龙血竭多成分在鼠脑中含量变化的影响，结合药效，分析Apt 15、Apt 29对龙血竭多成分向鼠脑选择性运输能力和药效协同作用。本研究交叉运用传统中医药理论与现代分子生物学技术，基于核酸适配体研究中药多成分靶点定位、选择性运输、效应成分群识别，具有明显的创新性，或为中药相关基础研究提供可借鉴的新思路及新方法。

新兴热点识别分子-核酸适配体（Aptamer），具有潜在确定药物靶点蛋白、增加药物靶向性、增加该药物选择性运输能力。本研究利用已知凝血酶核酸适配体Apt15，Apt29，开展了凝血酶、适配体和活血化瘀中药龙血竭的体内外相互作用研究，具体研究内容、相应结果、重要数据如下：.1）建立了分析体内外龙血竭多成分的HPLC-UV/MS分析方法 测定了龙血竭药材中龙血素A、龙血素B、龙血素C、紫檀芪、白藜芦醇、7,4-二羟基黄酮等药效成分的含量。测定了6种成分在大鼠血浆、粪便、尿液中含量，获取了相应的药物动力学参数和经粪便、尿液以及胆汁排泄规律。.2) 构建了体外微透析体系，利用建立的HPLC-UV方法，进行了龙血竭6种单体分子与牛凝血酶之间的体外相互作用研究。结果表明龙血素A、B、C和牛凝血酶有一定的相互作用。白藜芦醇、紫檀芪与牛凝血酶没有明显的相互作用。至少有3种物质（龙血素A、龙血素B、紫檀芪）可以穿过鼠脑血脑屏障。.3）利用亲和毛细管电泳（ACE）研究了龙血竭6单体分子与牛凝血酶/Apt15（29）两者体系中的相互作用。表明6种药物分子与牛凝血酶蛋白结合能力依次为龙血素A＞龙血素B＞紫檀芪＞白藜芦醇 ＞高异黄烷。药物分子与牛凝血酶较强结合，Apt29及15能与药物分子竞争结合牛凝血酶（Apt 29竞争结合力大于Apt15）。各种单体分子均与Apt 29/15有极弱的结合。.4）利用区带毛细管电泳（CZE）研究了龙血竭6种单体分子与人凝血酶/ Apt 29/15两者体系中的相互作用。结果表明，龙血素A与H-Thr的总亲和力nK为4.73×(10的四次方) /M，紫檀芪与H-Thr结合nK为1.63(10的五次方)/ M。龙血素B、龙血素C、白藜芦醇与H-Thr没有明显没有结合。H-Thr与高异黄烷有结合但无法测定结合常数。龙血素B、龙血素C、二羟基黄酮与Apt 29的结合常数依次为1.16、2.26×(10的四次方)/M、2.26×(10的四次方)/M，其他化合物未见与Apt 29结合。. 本研究采用HPLC-微透析联用技术、ACE、CZE技术，利用Apt15/29竞争与凝血酶结合的化学成分群，预测药物在蛋白的作用靶点（肝素和纤维蛋白原结合位点），并研究了Apt15/29对药物分子的靶向运输能力，为龙血竭药物分子的抗凝血药效靶点发现、物质基础识别提供了研究数据。