Toll样受体在呼吸机相关性肺损伤发病机制中的作用

Toll 样受体（TLR）表达于体内多种类型的细胞，对特异性和非特异性微生物刺激均可产生免疫应答。本项目在探讨TLRs 单核苷酸多态性与呼吸机相关性肺损伤的基础上，阐述不同通气模式肺组织中可溶性TLRs 蛋白含量的差异，探讨可溶性TLRs亚型在呼吸机相关性肺损伤中起到关键作用；应用流式细胞仪检测TLRs在各种通气模式中各类型细胞表面的表达；分离纯化巨噬细胞、淋巴细胞及TLRs其他表达细胞并进行体外培养，收集培养上清液检测其中可溶性TLRs 的浓度，确定何种细胞在呼吸机相关性肺损伤中主要分泌起关键作用的可溶性TLRs；应用抗TLRs 抗体和可溶性TLR2/IgG1 融合蛋白阻断大鼠肺损伤模型体内TLRs 的作用，观察其对肺损伤中炎症介质的影响。本项目的完成将首次阐明TLRs 在呼吸机相关性肺损伤发生机制中的作用，并将进一步明确呼吸机相关性肺损伤的发病机制。

目的：探讨Toll样受体在VILI发病机制中的作用。方法：选择健康成年雄性大鼠随机分为对照组(A组，自主呼吸组)，正常通气组（B组），过度通气组(C组)及大潮气量通气组(D组，VT-40 ml/kg)，每组15只，各组按通气时间(60min、120min和240min)分为3亚组建立动物模型。收集各组肺灌洗液及血清、肺组织，利用PCR、WB和ELISA等技术，检测炎性因子及可溶性TLRs表达；分析TLRs分泌的细胞来源；检测TNF-α刺激后炎性因子及TLR2、TLR4表达；封闭TLRs单抗阻断通路对模型中肺损伤程度的影响，研究VILI的信号传导通路。结果：（1）实验组中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α以及MIF均较对照组升高（P＜0.05），有统计学意义；（2）大潮气量组与对照组比较，TLR5、TLR6、TLR7、TLR8的mRNA表达无统计学意义（P＞0.05），而TLR2、TLR3、TLR4、TLR9、TLR10、TLR11、MyD88、NF-κB的mRNA表达明显高于对照组，有统计学意义（P＜0.05）；（3）TLRs分泌主要来源于巨噬细胞；（4）TNF-α体内刺激组（T组）比未刺激（C组）TNF-α、IL-1β,IL-6，IL-10表达均有明显升高，有统计学意义（P＜0.05），NF-κB mRNA，TLR2mRNA、TLR4mRNA MyD88mRNA 和蛋白表达明显升高，有统计学意义（P＜0.05）；（5）利用TLR2、TLR4单抗体内阻断，TLR2、TLR4基因及蛋白表达与对照组进行比较明显下调，有统计学意义（P﹤0.01）；（6）B、C两组肺泡巨噬细胞TLR9、MyD88、NF-κΒmRNA表达均比A组明显升高，有统计学意义(P＜0.01）；（7）A（双肺通气组）、B（单肺通气组）两组TLR2mRNA和TLR4mRNA表达的比较，B组明显高于A组，有统计学意义（P＜0.05）。结论：（1）大潮量通气可产生VILI；（2）TLR2、TLR3、TLR4、TLR9、TLR10、TLR11参与VILI的过程；（3）VILI过程中，MyD88、NF-κB的信号传导通路起到关键作用；（4）在VILI的信号传导过程中，TNF-α是启动的关键因子；（5）TLR单抗阻断可减轻VILI；（6）单肺通气时肺组织炎症反应明显。