人参皂甙Rd对NMDA型谷氨酸受体功能的影响及作用机制研究

人参皂甙Rd（Rd）是从中药三七中提取的活性单体皂苷。我们主持的全国多中心临床研究发现，Rd对急性缺血性脑卒中有显著疗效，但其机制不清。谷氨酸受体过度激活引发的兴奋性神经毒性是脑缺血损伤重要机制之一。我们研究发现，Rd可抑制谷氨酸和NMDA诱导的胞外Ca2+内流，提示其可能通过影响NMDA型谷氨酸受体（NMDAR）发挥神经保护作用。新近研究证实，脑缺血后Ca2+内流可激活死亡相关蛋白激酶1（DAPK1）、调节死亡信号通路（DSC）导致神经元死亡。因此，我们首次提出假设：Rd可能通过抑制NMDAR功能保护神经细胞，其机制与调控DAPK1-DSC信号通路有关。本研究拟采用激光共聚焦钙成像和全细胞膜片钳技术，以传统的药理学方法与先进的基因干预技术相结合，在细胞和分子水平研究Rd对NMDAR亚基的作用及可能的分子靶点，不仅可阐明Rd的脑保护机制，并为其成为治疗缺血性脑卒中的I类新药提供理论依据。

人参皂甙Rd（Rd）是从中药三七中提取的活性单体皂苷。我们主持的全国多中心临床研究发现，Rd对急性缺血性脑卒中有显著疗效，但其机制不清。以往研究报道，谷氨酸受体过度激活引发的兴奋性神经毒性是脑缺血损伤重要机制之一。我们前期研究发现，Rd可抑制谷氨酸和NMDA诱导的胞外Ca2+内流，提示其可能通过影响NMDA型谷氨酸受体（NMDAR）发挥神经保护作用。新近研究证实，脑缺血后Ca2+内流可激活死亡相关蛋白激酶1（DAPK1）、调节死亡信号通路（DSC）导致神经元死亡。因此，我们首次提出假设：Rd可能通过抑制NMDAR功能保护神经细胞，其机制与调控DAPK1-DSC信号通路有关。. 为此，本项目在国家自然科学基金（No. 81171236）资助下开展了以下工作：（1）探索Rd对NMDAR正常功能的影响；（2）研究Rd对NMDAR电流的作用特点；（3）研究Rd是否选择性作用于NMDAR亚基；（4）研究Rd作用于NMDAR亚基的可能分子机制。利用培养的大鼠皮层神经元结合多种细胞损伤模型，采用激光共聚焦钙成像和全细胞膜片钳技术，并给以药物与基因干预等手段，取得了以下重要结果：（1）Rd减少NMDA诱导的Ca2+内流；（2）Rd不影响正常培养神经元的电生理特性；（3）Rd减少正常及损伤神经元的NMDAR电流；（4）Rd选择性影响突触外NMDAR-NR2B亚基介导的NMDAR电流；（5）Rd不直接作用于NMDAR；（6）Rd影响损伤后NMDAR-NR2B亚基S1303位点的磷酸化；（7）Rd通过抑制DAPK激酶影响NMDAR-NR2B亚基S1303位点的磷酸化；（8）Rd通过促进DAPK磷酸化抑制抑制DAPK活性。. 基于以上研究结果，我们首次提出Rd神经保护的新机制：Rd通过磷酸化DAPK使之失活，DAPK失活可降低突触外NMDAR-NR2B亚基S1303位点的磷酸化水平，从而降低NMDAR介导的电流，减少Ca2+内流，从而发挥神经保护作用。因此，我们完成了本项目所有工作计划，揭示Rd神经保护可能性机制，为Rd治疗缺血性脑卒中的临床应用提供了科学依据。