人参皂甙Rd抗脑缺血兴奋性毒性损伤的NMDA受体机制研究

Ginsenoside-Rd (Rd) is one of the major active components from Pana Ginseng or Pana Notoginseng (Burk.) F.H. Chen (Araliaceae). Our randomized, double-blind, placebo-controlled and multicenter trials revealed that Rd showed efficacy and safety for the treatment of acute ischemic stroke. Our further data from animal experiments showed that Rd can significantly inhibit neuronal excitotoxicity, block NMDA-induced Ca2+ influx and attenuate NMDA-induced current, indicating that Rd may protect against ischemic stroke by affecting NMDA receptor activation. Based on the evidence that some ginsenosides can affect the function of NMDA receptor by binding to specific modulatory sites on NMDA receptor subunits, and NR2B, one of NMDA receptor subunits, is reported to be mainly responsible for neuronal excitotoxicity after ischemia stroke, we hypothesize that Rd may act on the certain key modulatory site of NMDA receptor NR2B subunit, subsequently affect the function of NMDA receptor and ultimately attenuate excitotoxicity. Therefore, in this project, taking advantage of molecular biology, laser confocal microscopic calcium imaging and whole-cell patch clamp; combining pharmacological and genetic intervention methods, we aim to explore the potential targets of NMDA receptor which Rd may act on at the level of NMDA receptor, NMDA receptor subunit and modulatory sites, and to test whether Rd may exert its effects through these potential targets in the transgenic animals. The results of this project will provide a theoretical basis for the neuroprotective effects of Rd, a promising I-class new drug in the treatment of cerebral ischemic stroke, and a guide for the pharmacological research of other Chinese herbal monomers and for the development of similar anti-excitotoxicity neuroprotectants.

人参皂甙Rd（Rd）是从人参或三七中提取的活性单体皂苷。我们主持的随机、双盲、安慰剂对照的多中心临床研究发现，Rd对急性缺血性脑卒中有显著疗效。近期我们动物实验发现，Rd具有显著的抗大鼠脑缺血兴奋性毒性损伤作用，可抑制NMDA诱导的钙内流及其受体电流，提示Rd可能通过作用于NMDA受体发挥神经保护作用。结合皂甙类似物可结合到NMDA受体亚基上的相关调节位点、NMDA受体NR2B亚基是兴奋性毒性主要参与者的报道，我们提出假说：Rd抗脑缺血兴奋性毒性的机制可能与其结合NR2B亚基上的关键调节位点有关。本研究拟采用钙成像、电生理、细胞转染等技术，以传统药理学方法与现代基因干预手段相结合，在NMDA受体、亚基及调节位点三个层面探索Rd的作用靶点，并在整体动物上进行验证，为Rd成为治疗缺血性脑卒中的I类新药提供理论依据，并为其他中药单体的药理学研究及类似抗脑缺血兴奋性毒性类神经保护剂的研发提供思路。

人参皂甙Rd（Rd）是从人参或三七中提取的活性单体皂苷。我们主持的随机、双盲、安慰剂对照的多中心临床研究发现，Rd对急性缺血性脑卒中有显著疗效。近期我们动物实验发现，Rd具有显著的抗大鼠脑缺血兴奋性毒性损伤作用，可抑制NMDA诱导的钙内流及其受体电流，提示Rd可能通过作用于NMDA受体（NMDAR）发挥神经保护作用。结合类似皂甙可结合到NMDA受体亚基上的相关调节位点及NMDA受体NR2B亚基是兴奋性毒性的主要参与者的报道，我们提出假说：Rd抗脑缺血兴奋性毒性的机制可能与其结合NR2B亚基上的关键调节位点有关。. 为此，本项目在国家自然科学基金（No. 81371365）资助下开展了以下工作：（1）探索Rd对NMDAR正常功能的影响；（2）研究Rd对NMDAR电流的作用特点；（3）研究Rd是否选择性作用于NMDAR亚基；（4）研究Rd调控NMDAR亚基的可能位点。利用培养的大鼠皮层神经元和动物脑缺血损伤模型，采用全细胞膜片钳技术并结合药物与基因干预等手段，取得了以下重要结果：（1）Rd不影响正常培养神经元的电生理特性，但可减少正常及损伤神经元的NMDAR电流；（2）Rd选择性影响突触外NMDAR-NR2B亚基介导的NMDAR电流；（3）Rd不直接作用于NMDAR；（4）Rd抑制损伤后NMDAR-NR2B亚基S1303位点的磷酸化；（5）Rd通过抑制DAPK激酶影响NMDAR-NR2B亚基S1303位点的磷酸化；（6）Rd通过促进DAPK的磷酸化抑制DAPK活性；（7）Rd通过抑制磷酸化酶Calcineurin，调控DAPK活性；（8）Rd可模拟Calcineurin抑制剂CsA发挥神经保护作用。. 基于以上研究结果，我们首次提出Rd神经保护的新机制：Rd通过抑制磷酸化酶Calcineurin，提高DAPK的磷酸化，从而使之活性降低；这可降低突触外NMDAR-NR2B亚基S1303位点的磷酸化水平，从而降低NMDAR介导的电流，减少Ca2+内流，从而发挥神经保护作用。因此，我们完成了本项目所有工作计划，揭示Rd神经保护可能性机制，为Rd治疗缺血性脑卒中的临床应用提供了科学依据。