HSV-2 LAT ORF 的抗凋亡作用及在蛋白水平上的调控机制

单纯疱疹病毒2型（HSV-2）是人类疾病的常见病原体，在体内易引起持续潜伏感染，当免疫力低下时，可反复被激活。HSV-2的潜伏感染是生殖器疱疹易复发，难根治的主要原因。潜伏相关转录体LAT是HSV在潜伏感染时唯一被大量表达的基因，可通过抗凋亡使HSV持续处于潜伏复发状态。本课题基于对LAT的最新认识，研究LAT ORF 的抗凋亡作用。以LAT的开放读码框ORF为研究起点，从蛋白水平上阐述这一机制。通过构建HSV-2 LAT ORF突变株，建立潜伏感染及再激活的细胞模型。通过凋亡诱导，对凋亡途径进行研究，探讨LAT 在蛋白质水平上的抗凋亡机制及其在病毒潜伏激活机制中的作用，并为HSV-2相关疾病的预防和治疗奠定理论基础。

生殖器疱疹（GH）主要由单纯疱疹病毒2型（HSV-2）感染所引起，该病毒具有嗜神经性，初次感染机体后可以在骶尾神经内建立终生潜伏感染，极难彻底清除，并可因多种非特异刺激而导致复发感染，潜伏相关转录体是HSV在潜伏感染期间唯一大量存在和可以被检测到的基因组转录产物，被认为在病毒潜伏的建立、维持、再激活等过程中都起着重要的作用，HSV-2 主要LAT由三个开放读码框（ORF1，ORF2，ORF3）构成，LAT潜伏的机制尚不明确，目前主流的观点主要有：LAT蛋白水平的抗凋亡作用和microRNA作用假说。. 本项目以HSV-2 333标准株基因组为模板，PCR分别扩增主要LAT的三个读码框ORF1,ORF2,ORF3，构建带有绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-ORF1，pEGFP-ORF2，pEGFP-ORF3，并将重组质粒pEGFP-ORF1，pEGFP-ORF2，pEGFP-ORF3转染SH-SY5Y神经细胞和Vero细胞，实现其在这两种细胞中的表达；构建了放线菌素D，5-氟尿嘧啶，顺铂诱导Vero细胞的凋亡模型；通过Gimesa染色，Hochest33258 荧光染色，MTT，流式细胞术，DNA ladder，caspase-3 活性检测等得出pEGFP-ORF1具有抗放线菌素D，pEGFP-ORF2具有抗5-氟尿嘧啶，pEGFP-ORF3具有抗顺铂诱导的凋亡作用。为进一步阐明LAT在HSV-2潜伏感染中的作用及机制提供了相关的实验依据，为治疗生殖器疱疹及彻底清除机体内的HSV-2病毒提供了一定的理论作用。