基于蛋白质组学技术的中药地龙溶栓活性组分解析及质量评价新方法研究

Earthworm, with multiple varieties, has been widely used as traditional anticoagulant and thrombolytic medicine, and the active components are considered to be a group of lumbrokinase. Presently, the studies about pharmacological activity mainly focus on three species, including Lumbricusrubellus, Lumbricusbimastus, and Eisenia fetida. There are four species recorded in Chinese Pharmacopoeia, involving Pheretima aspergillum E.Perrier, Pheretima vulgaris Chen, Pheretimaguillelmi (Michaelsen), and PheretimapectiniferaMichaelsen. But the active components are not clear so far. Our previous research indicated that they all have thrombolytic activity, but the active components were not the same as the lumbrokinase standard, which suggested that there might be other active proteins. Therefore, in this project, we intend to carry out quantitative proteomic analysis and bioinformatic analysis to efficiently analyze the thrombolytic activity proteins in the fresh and medicinal materials of earthworm based on the theoretical protein database. On the other hand, a strategy for enriching lumbrokinase will be developed. Subsequently, the reasonable Q-markers will be screened out on a basis of an extensive comparison study on proteins, peptides, and amino acids from different species of earthworm. Ultimately, a novel quality evaluation method using the active proteins as the Q-markers will be established. This study will provide vital reference for other traditional Chinese medicines with proteins or peptides as their active components.

中药地龙原动物为蚯蚓，品种繁多，作为抗凝血和溶栓药物，疗效显著，应用广泛，活性物质为一组蚓激酶，目前研究主要集中于粉正蚓、双胸蚓和赤子爱胜蚓。《中国药典》收载四个品种，参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉环毛蚓和栉盲环毛蚓，活性物质尚不明确，申请人前期研究中发现它们均具有溶栓活性，纤溶酶谱法分析显示活性组分与蚓激酶标准品不尽相同，说明地龙中还含有其他活性蛋白质。基于此，本项目拟开展定量蛋白质组学研究，结合生物信息学分析，在我们前期获得了地龙理论蛋白质数据库的基础上，快速、高效的解析地龙鲜品和药材中的溶栓活性蛋白。在明确溶栓活性组分的基础上，开发纤溶酶富集方法，从蛋白质、多肽和氨基酸三个维度对不同种属来源的地龙药材进行差异分析，筛选合理的评价指标，建立基于活性蛋白质的以蛋白、多肽和氨基酸为指标的质量评价新方法，为其他以蛋白质和肽类为活性物质的中药研究提供重要参考。

地龙是典型的动物来源中药，溶栓活性明确，应用历史悠久。《中国药典》收载地龙来源包括四个品种，参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉环毛蚓或栉盲环毛蚓，但是活性物质尚不明确，缺乏有效的质量评价方法，导致市场混乱，品质监管无据可依。基于此，本项目以药典收载地龙品种为研究对象，基于Label-free定量蛋白质组学技术，以前期建立的理论蛋白质数据库作为检索库，并结合生物信息学分析，快速、高效解析地龙中的溶栓活性蛋白，并筛选了合理的评价指标，建立了地龙质量评价新方法。主要包括开展了以下工作：1）通过蛋白质组学研究，明确了四种鲜品地龙蛋白质组学差异，并明确了其中的纤溶活性蛋白；2）比较了鲜品地龙组织和体腔液的蛋白质组差异，明确了溶栓活性蛋白在地龙不同部位的差异表达，为地龙药材合理使用提供理论支持，同时筛选出了可以表征地龙溶栓活性的标志肽，为建立含量测定方法奠定基础；3）采用TMT标记定量蛋白质组学技术，考察了干燥方式和温度对地龙溶栓活性物质的影响，为地龙加工炮制方法提供重要依据；4）以市售地龙药材为研究对象，采用多肽组学研究策略，通过统计分析，筛选出了地龙和常见伪品的特征肽，可用于地龙鉴别、掺伪检查的质控方法开发；5）通过对鲜品地龙活性提取部位的跟踪分离和分析，制备与表征地龙溶栓活性肽，为大规模筛选或鉴定具有溶栓活性的多肽提供了新的思路和技术；6）基于以上研究基础，建立了地龙质量控制新方法，包括特征肽鉴别、纤溶酶谱法鉴别、掺伪检查以及含量测定，可用于全面提高地龙质量标准。