基于蛋白质组学技术的哈蟆油鉴别和质量评价研究

According to the Chinese market, counterfeits and substitutes of Oviductus Ranae (OR) are more common, it serious influences the safety and efficacy of medicinal medication. We study the characteristics protein from frog’s fallopian tubes of different years and different species apply iTRAQ technology combined with MS. Some important proteins will be identified, and then clarified the regulatory pathways. Combined with the existing transcriptome databases verify the correlation between content and express of differential protein from mRNA level. The differential proteins have biological activity that will be established exclusive methods of qualitative and quantitative determination, which for the identification and quality assessment of OR provide reliable standards and technology platforms to ensure the safety and effectiveness of clinical application. This project apply proteomics and transcriptome techniques, and lay the foundation for further study of the clinical pharmacological mechanism of OR.

针对市场上中药材哈蟆油伪品、混品、造假情况多见，严重影响了该药材使用的安全性和有效性，本课题采用高通量的LC-MS/MS分离鉴定技术构建哈蟆油蛋白质表达谱，为探寻哈蟆油中已知/未知功能的蛋白质提供基础数据。以不同蛙龄的哈蟆油及其伪品油为研究对象，利用iTRAQ定量标记技术结合质谱分析，比较不同年限、不同种属蛙油蛋白质表达差异，鉴定一批重要的蛋白质，并阐明其调控途径，结合已有的转录组数据库从mRNA水平验证其差异相关性。对筛选出的具有一定活性的蛋白质，建立专属性的定性、定量方法，为哈蟆油药材的鉴定和质量评价提供可靠标准和技术平台，保证了临床使用的安全性和有效性。本课题结合蛋白质组学和转录组学技术，为进一步揭示哈蟆油的临床药理作用机制打下基础。

哈蟆油（Oviductus Rana，OR）为蛙科动物中国林蛙Rana temporaria chensinensis David雌蛙的输卵管，具有补肾益精、健脾益胃、滋阴补肾、润肺生津等功效，为滋补药材之首，具有较高的营养药用价值和经济价值。本项目主要研究哈蟆油的质量评价和真伪鉴别。1）建立了4种油蛋白质组数据库。以哈蟆油、青蛙油、蟾蜍油和牛蛙油为原料，采用iTRAQ结合2D LC-MS/MS技术，建立四种蛙油的蛋白质组数据库。通过对青蛙油、蟾蜍油、牛蛙油与哈蟆油蛋白质组数据进行差异分析，发现在哈蟆油中含量较高的特异性表达的蛋白质主要有3类：黏蛋白类（mucin-2、PREDICTED: mucin-5AC-like、mucin-5B），PREDICTED: a-kinase anchor protein 13-like， PREDICTED: IgGFc-binding protein-like；以上蛋白可作为哈蟆油区别于其它三种蛙油的标志性成分。采用家兔皮下注射，获得纯度大于95%的PREDICTED: a-kinase anchor protein 13-like多克隆抗体，应用Western blot的方法，可用于哈蟆油与伪品蛙油的鉴别。2）建立了不同蛙龄哈蟆油蛋白质组数据库。林蛙的蛙龄一般为7~8年，在2龄性成熟，开始产卵繁殖，3-4龄是壮年阶段，5龄以上进入老年期，因此选取具有代表阶段的林蛙2龄、3龄、5龄哈蟆油为原料，采用iTRAQ结合2D LC-MS/MS技术，建立不同蛙龄哈蟆油的蛋白质组数据库，通过蛋白质组学数据分析，筛选得到不同蛙龄哈蟆油差异表达的蛋白质共34个，其中3龄比2龄上调且5龄比3龄下调的蛋白质20个，这些差异蛋白主要参与哈蟆油的生长发育，能量代谢，物质转运，屏障保护等过程，通过qPCR验证和营养成分检测发现3龄林蛙输卵管物质代谢最旺盛，营养成分最丰富时期，是市场上质量最优的哈蟆油。3）采用两种蛋白酶酶解法制备得到哈蟆油蛋白多肽，研究其抗疲劳功效。结果发现哈蟆油蛋白多肽能提高机体运动耐力，改善机体能量代谢，降低血乳酸含量，从而延缓疲劳的产生和加速疲劳的消除，具有抗疲劳功效。本项目的研究成果可保证林蛙养殖业的可持续发展，进而获取较高的经济价值和社会效益。