基于苹果酸生物合成途径改造的碳代谢流调控及其机制解析

During the production of the desired metabolites, the titer, yield and productivity of the aim metabolites are determined by the distribution, flux and rate of the intracellular carbon flux. However, the physiological mechanism of the metabolic route affect the distribution, flux and rate of carbon flux still is issue. For this, with the synthetic pathway of L-malate (the theoretical yield is 148%): Phosphoenol pyruvic acid (PEP)-- Oxaloacetate(OAA)--L-Malate in E. coli ATCC 8759 as research model, the regulatory mechanism of rate-limiting enzyme-gene expression level-metabolic pathway and cell growth on the distribution, flux and rate of carbon flux were explore, through chemostatic culture, synthetic biological method, structural biological method and omic date. The results presented here could provide more understanding of the control mechanism of carbon flux. Furthermore, the results could provided more strategies to breed higher yield strain and optimize the fermentation process.

微生物合成精细化学品过程中目标产品的产量、产率和生产强度由碳代谢流流向、通量和速度所决定。然而，目标产品合成路径如何调控碳代谢流流向、通量及速度及其机制尚缺乏全局性的认识。本项目以E. coli中L-苹果酸合成途径(理论产率为148%)：磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)-草酰乙酸(OAA) -L-苹果酸为研究模型，借助恒化培养、合成生物学、结构生物学和组学数据解析等研究手段，通过改造关键酶、优化基因表达水平、基因删减、构建sRNA开关和代谢开关等方法调控碳代谢流流向、通量和速度，在此基础上结合生理参数和组学数据，阐明L-苹果酸合成路径调控碳代谢流的作用机制。研究结果进一步增强了对碳代谢流调控机制理解，同时为精细化学品高产菌株选育和生产路线优化提供了理论基础，因此具有重要的理论和实践意义。

（1）以大肠杆菌MG1655为宿主，引入来源于Synechocystis sp. PCC6803的5-磷酸核酮糖激酶、RuBisCO和碳酸酐酶(CA)，成功构建了RuBisCO支路；在此基础上，阻断L-苹果酸降解和碳流竞争途径并引入AsPCK和AsMDH，实现了协同CO2固定途径的重构，使得工程大肠杆菌GH089的CO2固定效率提高了49倍，L-苹果酸产量从7.9 mM增加到106 mM；进一步对协同CO2固定途径关键酶RuBisCO和CA进行表达比例优化，最优工程菌株GH389的CO2固定效率由36.5 mg/gDCW提升至49 mg/gDCW；利用3.6-L生物反应器对菌株GH389进行发酵，最终L-苹果酸产量达到387 Mm (51.8 g/L)；.（2）设计了一条由甲酸脱氢酶、甲酰基四氢叶酸环水解酶、亚甲基四氢叶酸脱氢酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、甲醛裂合酶(FLS)和二羟基丙酮激酶组成的新型CO2固定途径，命名为HWLS，并进行优化，将优化后的HWLS途径引入一株积累L-苹果酸的大肠杆菌FH0210，并与自组装CdS纳米捕光系统进行整合，所构建的工程菌株LF-2在蓝光、厌氧条件下将L-苹果酸得率从1.26 mol/mol提高至1.64 mol/mol；进一步优化发酵条件后，菌株LF-2在厌氧转化阶段L-苹果酸得率为1.85 mol/mol；.（3）设计了基于蓝细菌转录因子NdhR的动态调控开关，以及基于海洋浮游生物视紫红质蛋白的光驱动ATP再生系统。克隆来源于Synechocystis sp PCC 6803的转录调控单元PN和NdhR并进行理性改造，成功构建了可以响应大肠杆菌胞内α-酮戊二酸的分子开关PN-NdhR；利用开关PN-NdhR调控TCA循环起始基因gltA，实现了TCA循环的动态下调以及细胞整体CO2释放水平的降低；进一步构建基于视紫红质蛋白的ATP再生系统，完成了光驱动CO2减排系统的构建，与厌氧CO2固定系统进行两阶段发酵整合后，工程菌株LFM-2在整个发酵阶段的L-苹果酸得率达到1.48 mol/mol。