出芽短梗霉中β-聚苹果酸生物聚合途径解析及其代谢工程改造

Polyester consists of hydroxy acids connected by ester linkage. So far, the polyester produced by microbes that have been found only include poly(malic acid) (PMA) and polyhydroxyalkanoates (PHA). The bio-polymerization characteristic of PMA is different from that of PHA, indicating that PMA probably represents a novel bio-polymerization mechanism of polyester, but the bio-polymerization pathway of PMA has not been elucidated.Previous studies proved that only the yeast-like cells of Aureobasidium pullulans can synthesize PMA, and malic acid is adenylated prior to bio-polymerization. Based on these results, a rational gene mining strategy was proposed in this study. Suppression subtractive hybridization will be employed to construct the particularly expressed gene library of yeast-like cells of A.pullulans; according to the coupling characteristic between adenylate-forming enzyme and synthase system of PMA, the genes involved in bio-polymerization of poly(β-malic acid) will be obtained from the library, and the catalytic function of poly(β-malic acid) synthase system will be elucidated; Finally, the bio-polymerization pathway of poly(β-malic acid) will be added into the genome-scale metabolic model (GSMM) of A.pullulans, and the modified GSMM will be used to predict the rate-limiting step of PMA biosynthesis and the unnecessary metabolic pathway, which will guide the metabolic engineering of A.pullulans. This study will obtain the genes and catalytic functions of bio-polymerization pathway of PMA, which can preliminarily elucidate the bio-polymerization mechanism of PMA, and guide the research of biosynthesis mechanism and metabolic engineering of biopolyester.

聚酯是由羟基酸类化合物通过酯键连接而成的聚合物，目前自然界发现的微生物合成的聚酯，仅有聚苹果酸（PMA）和聚羟基脂肪酸酯（PHA）。PMA生物聚合反应特征与PHA不一致，极有可能代表了一种新的聚酯生物聚合机制，但是其生物聚合途径尚不明朗。出芽短梗霉是PMA的主要生产菌株，该菌只有在酵母状形态才能合成PMA，且合成过程中苹果酸单体通过腺苷酰化反应活化。基于此，本项目设计了理性的基因挖掘策略，采用消减抑制杂交技术，构建出芽短梗霉酵母状细胞特异性表达基因文库；根据聚苹果酸腺苷酰化酶与合成酶系基因偶联特征，从文库中挖掘PMA合成酶系基因并解析各组分功能；基于以上成果修正出芽短梗霉基因组尺度代谢网络模型，使用模型预测PMA生物合成限速步骤及冗余代谢支路，进行代谢工程定向改造。本项目将阐明PMA生物聚合途径，初步解析PMA生物聚合机制，为聚酯的生物聚合机制和代谢改造研究提供借鉴。

聚酯是一类性能优异、用途广泛的高分子化合物，目前自然界发现的微生物合成的聚酯，仅有聚苹果酸（PMA）和聚羟基脂肪酸酯（PHA），PMA生物聚合特征与PHA不一致，极有可能代表了一种新型聚酯生物合成机制，但是负责聚合反应的聚苹果酸合成酶（系）尚未解析。课题组前期研究发现，作为PMA主要生产菌株的出芽短梗霉，在其代谢过程中有酵母态和菌丝体态两种形态，仅有酵母态细胞可以合成PMA，且聚合过程中苹果酸通过腺苷酰化反应活化。基于此，本项目开展了以下研究：（1）挖掘聚苹果酸合成酶，解析聚苹果酸生物聚合机制。采用消减抑制杂交技术，筛选酵母态细胞特异性表达基因58个，根据腺苷酰化酶的保守序列，挖掘到1个目的基因，经基因敲除和回补实验验证，证实该酶是聚苹果酸合成酶（PMAs）。PMAs是由1681个氨基酸编码的多结构域酶，由腺苷化结构域、巯基化结构域和缩合结构域组成，苹果酸单体在该酶催化下，依次发生腺苷化反应、巯基化反应和缩合反应聚合为聚苹果酸。（2）在修正的基因组尺度代谢网络模型（GSMM）指导下进行菌株代谢工程改造。以GSMM模型iZX637为基础，添加聚苹果酸合成酶反应后进行修正，在修正模型指导下，分别过表达聚苹果酸合成途径的4个限速酶基因：葡萄糖激酶、异柠檬酸裂解酶、苹果酸合成酶和丙酮酸羧化酶，聚苹果酸产量均有不同程度提高，其中过表达丙酮酸羧化酶后聚苹果酸产量最高增加18.1%。（3）出芽短梗霉以乳清为原料发酵聚苹果酸的应用研究。乳清的主要成分是乳糖，但是出芽短梗霉无法分解乳糖。使用乙醇对马克思克鲁维酵母进行通透化处理后，该细胞的β-半乳糖苷酶酶活高达236.5 IU/g。将出芽短梗霉与通透化处理细胞共培养，无需使用商品酶β-半乳糖苷酶对乳清预处理，即可一步法发酵聚苹果酸，聚苹果酸发酵终浓度达97.3 g/L。该研究开辟了一条聚苹果酸低成本生产的优选路线。