KCNQ钾通道调控机制的单通道功能与结构研究

本项目拟综合运用单通道电生理技术、分子克隆、结构分析、X-射线蛋白晶体衍射技术，以阐明PIP2调控KCNQ钾通道的分子机制。由于PIP2的作用非常广泛，PIP2的水解产物IP3和DAG都是第二信使，因此阐明PIP2与KCNQ通道结构与功能的机制，对于理解其他通道和受体的调控机制也有指导意义，对于药物设计和新药开发更有实际的应用价值。本项目的实施综合了我们在单通道技术和结构生物学的优势，研究结果将有力地推动我国对离子通道生理学和药理学机制的研究。

KCNQ钾通道是在较低电压条件下激活的电压门控钾通道，对于维持膜电位在静息水平有重要的作用, 在过去的三十年里一直是一个研究热点。目前普遍接受的KCNQ钾通道的最直接调控因子是PIP2。PIP2可直接调控通道的开放和关闭，但是在分子水平上，PIP2是如何和通道结合并影响通道的功能？为了回答这些问题，我们综合单通道膜片钳电生理、分子克隆、结构分析和蛋白纯化及晶体衍射技术相结合，来研究三个主要问题：1. 单通道电生理来测量PIP2对通道门控过程（gating kinetics）的影响。2. 开展对KCNQ钾通道的全长及各个结构域的表达纯化。3.发现新的PIP2与KCNQ钾通道的结合位点，阐明PIP2调控KCNQ钾通道的动态机制。.我们四年来针对KCNQ钾通道进行了多方面的大量研究工作，取得了一些的重要发现。总结如下：1. 通过单通道记录方法和动力学参数的分析，阐明了PIP2对KCNQ钾通道的单通道动力学过程的作用。我们记录和分析了可溶性的短链DiC8-PIP2和全长PIP2对KCNQ钾通道单通道的作用，明确了PIP2 的极性头部与通道有直接的相互作用，而PIP2脂质尾部的长短决定了其解离和对通道作用的亲和力。2. 开展对KCNQ钾通道的蛋白纯化和结构生物学研究，建立了膜蛋白结构生物学研究技术平台。我们对KCNQ2、KCNQ4等一系列与重大疾病相关的离子通道，对其跨膜区、胞内区以及多个结构域，进行了表达纯化，并完善了高通量结晶条件筛选技术。3. 我们发现在脂质分子-膜蛋白的界面上，尤其在S4-S5 linker和S2-S3 linker以及S6的末端，存在多个PIP2结合位点；PIP2在与KCNQ钾通道的相互作用存在动态的迁移过程；同时PIP2把通道的不同亚基偶联起来，形成一个稳定的四聚体，发挥协同作用，从而稳定了通道的开放状态。4. 我们还发现了一种全新的阴离子选择性的机械门控通道（TtMscS )。本项目的研究成果使我们对KCNQ钾通道的结构与调控机制有了较系统、完整的理解，对于作用广泛的PIP2对其他膜蛋白的作用机制也有重要的借鉴和指导作用，对于药物设计和新药开发更有实际的应用价值。.本基金的支持，还培养了两位博士后和三位研究生，在Scientific Reports、PNAS等杂志发表了6篇学术论文。