副猪嗜血杆菌表面蛋白与猪补体系统的相互作用及其分子机制研究

补体系统是天然免疫的核心组成部分，激活后可导致病原菌的裂解和调理吞噬的增强。细菌表面蛋白(酶)可阻断补体的激活，有助于病原菌的入侵和感染。最近研究表明副猪嗜血杆菌(Hps)可逃避宿主补体的攻击，但具体的作用机制不详。本课题组的相关研究表明，与猪补体系统可能相互作用的Hps表面蛋白有VtaA、类Mac和AT1-pd。本项目先通过PCR对上述蛋白基因在不同Hps菌株中进行检测以确认其与Hps毒力的相关性，再利用重组蛋白与超表达重组菌株进行血清抗性和吞噬试验，证实其与补体系统的相互作用，接下来通过免疫共沉淀和配体印迹分析试验鉴定与细菌表面蛋白（酶）互作的补体分子，最后分析、证实并阐明Hps逃避宿主补体攻击的分子机制。本项目从免疫逃避的角度开展研究，不仅拓宽了Hps致病机制的研究方向，而且鉴定的细菌表面蛋白有望成为Hps新型基因工程疫苗设计和药物筛选的靶标，具有重要的理论意义和潜在的应用价值。

补体是人和动物免疫系统的主要组成部分，在机体的天然免疫和获得性免疫中发挥重要作用。副猪嗜血杆菌作为一种猪上呼吸道的常在菌，在从定殖到全身感染的过程中，与补体系统的相互作用至关重要。本项目拟研究副猪嗜血杆菌的蛋白(酶)与宿主补体分子之间的相互作用以阐明其感染的机制。但前期的研究结果表明，我们预测的蛋白（酶）与宿主补体之间并无直接的相互作用，然而我们发现糖类组份和糖代谢与修饰的酶类可能与补体系统的作用更为密切。. 我们用重组的类Mac蛋白与血清补体的相互作用后，再用该血清进行杀菌实验，结果表明重组类Mac蛋白似乎可以提高副猪嗜血杆菌的血清抗性。我们构建了该蛋白的两个基因at1和at2单基因缺失株以及双基因缺失株进行了血清抗性试验，但发现缺失株的血清抗性是增强而非减弱的。对其原因进一步探索，我们发现缺失株血清抗性的增强与多糖合成蛋白基因capD、多糖输出蛋白基因wza、神经氨酸酶基因nanH等的上调表达相关。我们构建了SH0165的capD基因缺失株，发现其血清抗性发生显著降低，亲本菌株的存活率为60%，而缺失株则下降为0。与此同时，我们构建了JL0135的nanH基因缺失株，也证实了该缺失株血清抗性的下降。进一步研究表明，JL0135△nanH血清抗性的下降是由于表面沉积的特异性抗体IgG和补体分子C3b的增加，从而加强了对补体经典途径的激活。与此同时，我们发现了类Mac蛋白的缺失引起了副猪嗜血杆菌的吞噬抗性降低，所以认为类Mac蛋白在副猪嗜血杆菌感染过程中的直接作用更可以能是增强细菌的吞噬抗性。. 以上研究结果表明在副猪嗜血杆菌与补体系统相互作用的过程中，构成细菌主要组份的糖类及其代谢修饰酶类的研究也值得重视和深入研究。一些蛋白（酶）应该与补体系统也存在相互作用，但它们与宿主相互作用的靶标更倾向于天然免疫系统中的吞噬细胞，比如肺泡巨噬细胞和嗜中性粒细胞以及血浆中与天然免疫相关的蛋白因子。