副猪嗜血杆菌自转运蛋白的功能及其在致病中的作用研究

副猪嗜血杆菌是当前影响世界和我国养猪业的重要病原菌，但其毒力因子和致病机制不清。本实验室完成了高毒力副猪嗜血杆菌的全基因组测序和转录组学研究，发现自转运蛋白是其可能的毒力因子。自转运蛋白是革兰氏阴性菌的外膜蛋白或分泌蛋白，不仅与细菌的粘附、入侵和细胞毒性等有关，而且能诱导机体产生保护性免疫。本项目拟以副嗜血杆菌中发现的3个自转运蛋白作为研究对象，首先通过免疫印迹确定其转运到菌体外是外膜蛋白还是分泌蛋白，然后根据其在菌体外的存在形式进行粘附与入侵试验或者结合与细胞毒性试验，研究其与猪气管上皮细胞的相互作用，再对自转运蛋白分段表达以确定其功能域，最后构建自转运蛋白功能域缺失的突变株，进行竞争感染试验及病理学观察和组织细菌定量分析，最终阐明副猪嗜血杆菌自转运蛋白的功能及其在致病中的作用，为副猪嗜血杆菌粘附、入侵和致病机制的深入研究奠定基础，也为副猪嗜血杆菌基因工程疫苗研究和药物设计提供理论依据。

自转运蛋白（Autotransporter，AT）属于细菌的外膜蛋白或分泌蛋白，在细菌的定殖与感染中发挥多种作用。本项目表达了副猪嗜血杆菌的3个自转运蛋白并制备单抗，通过Western blot证实了AT1的承载结构域位于细菌外膜，而AT2和AT3的承载结构域则分泌到培养上清。粘附和结合实验的结果表明，AT1可以介导副猪嗜血杆菌粘附到猪气管上皮原代细胞，而且AT2和AT3也可以粘附到猪气管上皮原代细胞，表明了ATs蛋白在副猪嗜血杆菌感染过程可能发挥特定的作用。与此同时，在使用本项目所建立的温敏突变系统难以获得无抗性突变株的情况下，我们改用自然转化的方法获得了含有抗性标记的AT2和AT3的单基因和双基因缺失突变株。野生菌株与突变菌株的血清杀菌实验表明AT2和AT3的缺失导致了细菌的血清抗性的降低，提示AT2和AT3可能与补体系统存在相互作用，有助于副猪嗜血杆菌对抗宿主的天然免疫。