SUMO化修饰对拟南芥花粉管关键质膜Ca2+通道CNGC18的功能调控研究

CNC18 (Cyclic Nucleotide-Gated Channel 18) is a key plasma membrane Ca2+ channel in pollen tube tips for the pollen tube polarized growth and guidance in Arabidopsis, and thus its activity must be precisely regulated by both activators and inhibitors. Some activators of CNC18 have been reported, but the inhibitors of CNGC18 are largely unknown. Our preliminary data showed that CNGC18 contained sumoylation consensus motifs, and the mutation of one of the motifs increased the Ca2+ channel activity of CNG18, which suggest that CNGC18 is inhibited by sumoylation. Therefore, in this project, we will first detect whether CNGC18 is sumoylated using Co-IP test, and then determine the sumoylation sites of CNGC18 by liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and site-directed mutational analysis. After that, the techniques and methods such as patch-clamping and Ca2+-imaging techniques will be applied for investigation of the effects of sumoylation on the channel activity, the localization and the activation mechanisms of CNGC18. Together, this research will help to identify the inhibitors of CNGC18, and shed new light on the mechanism of pollen tube polarized growth and guidance.

拟南芥花粉管质膜Ca2+通道CNGC18（Cyclic Nucleotide-Gated Channel 18）在花粉管极性生长和方向控制中发挥关键作用，因此其活性必须受到激活和抑制的精细调节。但目前只有CNGC18激活因子的报道，对CNGC18的抑制因子研究极少。预实验发现CNGC18含SUMO（small ubiquitin-like modifier）修饰基序，并且破坏该基序能显著增加CNGC18的通道活性，暗示SUMO化修饰是CNGC18的抑制因子。在预实验基础上，本项目拟首先利用Co-IP技术直接检测CNGC18是否被SUMO化修饰，然后通过蛋白质谱技术确定CNGC18的SUMO化修饰位点，最后用膜片钳和活体Ca2+成像等技术研究SUMO化修饰对CNGC18的通道活性、膜定位及其激活机制的影响。该研究将有助于鉴定CNGC18的抑制因子，加深人们对花粉管极性生长和方向控制的认识。

植物种子不仅是高等植物重要的繁殖方式，也是人类重要的食物来源，而植物的双受精是植物产生种子的关键。在植物双受精的过程中，花粉粒落在柱头上，随后吸水、萌发并长出花粉管；花粉管在花柱中快速极性生长，响应来自胚珠的吸引信号，进入珠孔；最后花粉管破裂、释放出两个精核，两个精核分别和卵细胞与中央细胞中的极核融合，完成双受精。大量研究表明，花粉管快速极性生长与准确导向受到花粉管顶端游离钙离子浓度梯度的调控，而我们之前的工作发现拟南芥CNGC18（cyclic nucleotide gated channel 18）基因编码了一个花粉管质膜钙离子通道，并且CNGC18在花粉管顶端游离钙离子浓度梯度的建立和维持中必不可少。.作为一个花粉管质膜钙离子通道，CNGC18的通道活性调控是花粉管快速极性生长和准确导向的关键。我们起初根据生物信息学的预测，计划探究SUMO化修饰对CNGC18的功能调控，然而后续研究发现CNGC18不受SUMO化修饰，而受到其同源基因CNGC7和CNGC8以及钙调素的调控。利用爪蟾卵母细胞表达系统，我们发现CNGC18具有钙离子通道活性，CNGC7和CNGC8都没有钙离子通道活性，而CNGC7或CNGC8能够抑制CNGC18的钙离子通道活性，并且钙调素可以解除CNGC7或CNGC8对CNGC18通道活性的抑制。我们随后运用双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation）、单分子荧光成像（single-molecule fluorescence imaging）、酵母双杂交技术、表面等离子共振技术（surface plasmon resonance）和电生理技术发现CNGC7或CNGC8能够和CNGC18、钙调素形成一个复合体，并且该复合体的钙离子通道活性受到钙离子浓度的调节。在高浓度钙离子条件下，结合钙离子的钙调素会从CNGC8-CNGC18-钙调素复合体上脱离，钙离子通道关闭；在低浓度钙离子条件下，未结合钙离子的钙调素会结合到CNGC8-CNGC18-钙调素复合体上，钙离子通道开放。以上结果表明在植物花粉管中CNGC8（或CNGC7）-CNGC18-钙调素能够形成一个钙离子浓度震荡器。我们的研究揭示了植物花粉管中游离钙离子浓度震荡的一种可能机理，为进一步研究花粉管快速极性生长和准确导向提供了重要基础。