拟南芥CNGC18的离子通道功能鉴定、活性调控机制及其在花粉萌发和花粉管极性生长中的关键作用的研究

CNGC18在花粉萌发和花粉管生长中的功能和活性调控机制还不清楚。本研究首先采用电生理技术分别对cngc18拟南芥突变体和野生型花粉细胞以及异体表达CNGC18基因的HEK293细胞的内向质膜钙电流进行检测，研究CNGC18是否具有离子通道功能，并搞清其对钙和钾等阳离子的相对通透能力；研究CNGC18的离子通道活性是否受环核苷酸、微丝骨架和胞质pH的调控，揭示CNGC18的活性调控机制；采用在HEK293细胞中异体表达和双分子荧光互补技术相结合的方法，研究CNGC18功能蛋白包含单个还是多个蛋白亚基，之后通过蛋白提纯、交联和电泳等手段，揭示CNGC18功能蛋白的高级分子结构；最后，通过GFP标记和转基因，观察CNGC18蛋白从合成到插入花粉管顶端质膜的整个运动过程。本研究将阐明CNGC18的功能、调控机制、蛋白结构和运动规律，从分子到细胞，全面加深我们对花粉萌发和花粉管极性生长机制的理解。

CNGC18是一个环核苷酸门控离子通道家族的成员，其突变导致拟南芥致死性的雄性不育表型，提示其在雄性生殖细胞中具有关键功能，并推测其为一种Ca2+通道。但其Ca2+通道的功能和活性调控机理还缺乏实验证据的支持。本项目拟研究CNGC18的蛋白功能，阐明其分子调控机理，以及其在花粉管极性生长中的作用和活性调控机理。因为CNGC18敲除突变体的致死表型，导致其纯合突变体无法存活，也因此无法用于关于CNGC18的研究。我们借助HEK293T异源表达体系，结合膜片钳技术，对其通道特性进行了详细的鉴定。研究结果显示，在异源表达CNGC18的HEK293T细胞中，我们记录到了典型的内向超极化激活的通道电流，而在对照组HEK293T细胞中仅能记录到微弱的背景电流信号。胞外Ca2+的移除则直接导致内向电流的消失，而细胞外Ca2+浓度升高或降低，则导致逆转电位向正电压方向或负电压方向移动。Ca2+通道抑制剂La3+和Gd3+均可以完全抑制该内向电流。这些结果清楚的表明，CNGC18是一种内向Ca2+通道。为了进一步鉴定其离子选择性，我们将胞外Ca2+换成相同浓度的Ba2+，我们在表达CNGC18的HEK293T细胞中记录到了类似的电流信号，电流幅度基本一致，而将胞外Ca2+换成K+,则记录不到任何电流信号，说明CNGC18对K+没有明显的通透能力。考虑到胞外存在超过100mM的NaCl，在胞外Ca2+或K+被移除的情况下，仅能记录到微弱的背景电流信号，说明CNGC18对Na+没有明显的通透能力。该结果表明，CNGC18对二价阳离子具有很强的通透能力，但在二价阳离子之间缺乏选择性；同时，CNGC18对Na+和K+没有明显的通透能力，表明其为二价阳离子选择性的内向二价阳离子通道。我们进一步研究发现，CNGC18可以被环核苷酸激活，且其功能蛋白是同源多聚体。该研究的实验结果已经在线发表在国际知名期刊Molecular Plant上。