减毒百日咳杆菌BPZE1对甲型流感病毒感染非特异性保护作用的抗炎症机制研究

The threat of a pandemic spread of highly virulent in?uenza A viruses currently represents a top global public health problem. However, current vaccination strategies face the challenge to meet the demands in a pandemic situation. Effective immuno-protection mechanisms against influenza infection also remains a hot research topic. In a mouse model of severe in?uenza virus-induced pneumonitis, we observed that prior nasal administration of an attenuated strain of Bordetella pertussis (BPZE1) provided effective and sustained protection against lethal challenge with two different in?uenza A virus subtypes, H3N2 and H1N1. We demonstrated that the protective mechanism does not involve cross-reactive B. pertussis-specific antibodies or T cells. Instead, we showed that prior nasal live BPZE1 treatment prevented virus-induced lung inflammation and death by suppressing the production of major pro-inflammatory mediators. Furthermore, nasal pretreatment with BPZE1 also effectively protected ovalbumin(OVA)-induced allergic airway inflammation and dinitrochlorobenzene(DNCB)-induced contact hypersensitivity (CHS) in preclinical murine models through its broad anti-inflammatory properties.BPZE1 thus represents a potential universal prophylactic agent against highly pathogenic influenza A viruses and allergic diseases. Nevertheless, the cellular and molecular mechanisms involves in the cross-protection are not clear and deserves further investigation.In this project, we propose to decipher the mechanisms and identify the cellular and molecular players involved in the protective effect of BPZE1 against influenza A viruses. We propose to perform a series of FACS analysis, in vivo depletion and adoptive transfer experiments,in vitro suppression experiments as well as using transgenetic mice, to test the potential role of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells(Tregs), aveolar macrophages, non-regulatory CD4+ and CD8+ T cells in the protection.This study will provide useful information on influenza vaccine and drug design, and may also be the basis for study the mechanisms involved in the cross-protection of BPZE1 against asthma and CHS.

有效抵御流感病毒的免疫保护机制是流感病毒研究领域的重要问题之一。宿主过度炎症和高细胞因子反应在重症流感病毒引起的死亡和急性肺损伤中起重要作用。我们前期研究发现，在小鼠模型中，鼻粘膜接种减毒百日咳杆菌BPZE1通过其广谱抗炎症特性抑制疾病相关促炎因子产生，有效抵御流感病毒H3N2和H1N1致死性感染以及过敏性哮喘和接触性超敏反应的发生。但其中的发挥作用的具体免疫学机制还不清楚。基于进一步实验结果，本项目拟通过BPZE1对流感病毒H3N2非特异性保护小鼠模型，采用流式细胞分析、转基因小鼠、体内细胞清除、过继转移及体外抑制实验方法，深入研究Foxp3+调节性T细胞、肺泡巨噬细胞、CD4+和效应CD8+T细胞在其中的作用。本研究对阐明BPZE1广谱抗炎症特性对重症流感病毒的免疫保护机制有重要意义，为抗流感病毒疫苗和药物设计提供思路，对研究BPZE1保护另外两种过敏性疾病机制奠定基础。

本项目旨在减毒百日咳杆菌BPZE1对流感病毒非特异性保护模型中，通过流式细胞分析、转基因小鼠、体内细胞清除、过继转移及体外抑制方法，研究Foxp3+调节性T细胞、肺泡巨噬细胞、CD4+和效应CD8+T细胞在其中的作用，进而阐明BPZE1广谱抗炎症特性对重症流感病毒感染的免疫保护机制，为抗流感病毒疫苗和药物设计提供新思路。但是，由于BPZE1的使用权受到限制（在此前年度进展报告中已详述），因此，该项目的主要工作更改为两部分：一部分为构建具有自主知识产权的减毒百日咳菌株；另一部分为研究如何在疫苗免疫接种时在质和量上提高特异性CD8+T细胞，从而提高一些需要大量CD8+T细胞免疫反应的疾病的保护作用。.第一部分工作中我们通过使用自杀载体pJQ200mp18-rpsl通过2次同源重组对主要毒性因子百日咳毒素（PTX）和皮肤坏死毒素（DNT）进行敲除，并用大肠杆菌ampG基因代替百日咳杆菌的ampG基因从而降低气管细胞毒素（TCT）产生。目前已成功获得2株三突变减毒百日咳菌株，正在对其功能和肺部定植进行鉴定。同时我们也在构建另外一株PTX和 sigE双重缺陷减毒百日咳菌株。sigE编码一个介导细胞膜对外界刺激应答的功能性sigma因子。SigE调控子介导着与细菌毒力相关的一系列功能。因此，SigE可能为百日咳杆菌新的毒性因子。目前，构建工作正在进行中。这部分工作为拥有具有自主知识产权的产品开发奠定了基础。.第二部分工作利用CXCR3和CCR5小分子拮抗剂TAK-779，研究免疫过程中通过抑制炎症趋化因子受体CXCR3和CCR5短暂抑制免疫/感染过程中的炎症反应对提高记忆性CD8+T细胞免疫应答效果。我们发现TAK-779能够在质和量上显著提高流感病毒NP蛋白特异性的记忆性CD8+T免疫应答，CD8+CD127+记忆性细胞前体显著增多，而CD8+CD69+终极分化效应细胞前体显著减少。这些记忆性CD8+T细胞在再次接触相同抗原时能够分化为分泌IFN-γ的效应细胞，并且在免疫过程中使用TAK-779能够显著降低小鼠在攻毒实验中肺部病毒载量并提高了存活率。这部分研究为如艾滋病、肺结核和疟疾等需要大量CD8+T细胞才能达到有效预防的疾病提供了免疫新思路，并为新药研发奠定扎实的基础。