基于整体观的芦荟激活Wnt/β-Catenin/APC信号通路物质基础和作用机理研究

The Wnt signaling pathway is one of the most important pathway that’s closely associated with cancers, which contributes to various tumors when abnormally expressed or activated. We previously found that one of the common used Chinese herbs aloe which could remarkably activate the Wnt pathway with an extremely low concentration, and the activation of Wnt signal showed a strong dose-dependent relationship with the level of aloin (a kind of anthraquinones) in aloe but not when treated with the individual aloin. On the contrary, aloe-emodin showed an inhibition of the Wnt pathway in our previous study. What constituents of aloe primarily contribute to activate the Wnt pathway? And what steps of Wnt pathway are mainly affected by these constituents? How to optimize the aloe extraction process to reduce its toxic and side effects? Based on the holistic approach, this research aims to use the separation technology and Chemical markers’ fishing and knockout method to screen the active components of aloe and study the mechanism of how they influence the transcription and translation of the key proteins of Wnt pathway (β-Catenin) and colon cancer (APC), as well as optimize the aloe extraction process. This research would benefit the safety studies of aloe, and provide methodology references for the researches of material basis and the mechanisms for the herbs with a regulatory function of Wnt signaling pathway.

Wnt通路是与癌症密切相关的细胞信号通路之一，它的激活将导致多种肿瘤的发生和发展。我们前期发现芦荟在很小剂量时就可激活Wnt通路，进一步研究表明其激活强度与蒽醌类成分芦荟苷的含量呈较强剂量关系，但芦荟苷自身却没有激活作用，芦荟大黄素反而有抑制作用。在多成分共存情况下，究竟哪些成分使得芦荟在整体上可激活Wnt通路？这些成分又通过调节哪些环节发挥作用？该如何降低这些毒性成分的含量以保证使用安全性？本项目针对以上问题，在已有工作基础上，采用整体观思路，拟将系统分离和敲入/敲除相结合，进行芦荟不同组分、成分及组合对Wnt通路活性的影响来筛选毒性物质，分析它们对经典Wnt通路中关键蛋白β-Catenin以及与结直肠癌密切相关的APC蛋白表达和转录的影响来探讨作用机理，并结合动物实验来制定安全芦荟的限量标准。本项目的开展将为更深入认识芦荟的安全性提供依据，也为其它调节Wnt通路中药的相关研究提供示范。

Wnt信号通路与结直肠癌的发生发展密切相关，研究表明长期口服芦荟产品会导致结直肠癌，这可能与其激活Wnt信号通路有关。基于此，本项目将系统分离和敲入/敲出相结合，研究芦荟激活Wnt信号通路的物质基础和分子机制。首先，我们采用HPLC对芦荟水提取物进行了主要成分的指认和含量测定，发现主要成分是芦荟苷（68%），芦荟苦素（11%）和异芦荟色苷D（20%）。其次，我们采用荧光素酶报告基因实验在NIH/3T3细胞上测试了芦荟提取物和三种主要成分对Wnt信号通路的影响。结果表明低剂量的芦荟提取物、芦荟苷和芦荟苦素能够协同Wnt3a激活Wnt信号。第三，我们采用两步法高速逆流色谱将芦荟苷、芦荟苦素敲出，并探究不同敲出部分及其组合对Wnt信号的影响。结果显示，敲出剩余部分对Wnt信号无明显影响，芦荟中其他微量成分可能起到辅助作用。第四，我们验证了芦荟提取物、芦荟苷、芦荟苦素对Wnt信号通路靶基因和关键蛋白的上调作用，并证明芦荟提取物、芦荟苷的作用依赖于Wnt3a的存在，而芦荟苦素可以直接激活Wnt信号。第五，我们证明了芦荟提取物、芦荟苷、芦荟苦素在低剂量短期体内外实验中对结直肠癌的发生发展没有明显的促进作用。第六，我们通过转录组学方法发现芦荟提取物、芦荟苷、芦荟苦素能都显著调节结直肠癌RKO细胞内基因的可变剪接过程，说明芦荟可能通过其转录后水平的调控活性实现对Wnt信号的激活作用。综上所述，本研究虽证明了低剂量芦荟及其化学成分确能激活Wnt信号，却未发现芦荟促进结直肠癌发生发展的直接证据，但因Wnt信号通路和结直肠癌密切相关，因此口服芦荟仍存在安全隐患，芦荟的安全性仍需要谨慎评估。在项目成果方面，本项目已经发表SCI论文5篇，中文核心期刊论文1篇，1项专利已公布，并有一篇SCI论文在投。此外，参与学术会议5次/5人次，在大会作报告4次。已毕业硕士研究生3名，在读研究生2名。